肿瘤坏死因子α通过核因子κB促进肝癌细胞上皮间质转化

目的研究肿瘤坏死因子α(TNF-α)对肝癌细胞上皮间质转化(EMT)的影响并探讨其分子机制。方法用TNF-α处理人肝癌细胞株(Hep3B和SMMC-7721)24h,倒置显微镜下观察处理前后细胞形态的变化,采用荧光定量RT-PCR和蛋白质印迹分析方法检测细胞中上皮细胞标记物上皮性钙黏蛋白(E-cadherin)和β-连环素(β-catenin)、间质细胞标记物波形蛋白(Vimentin)和神经性钙黏蛋白(N-cadherin)以及转录调控因子Twist的表达变化,Transwell及划痕实验分析细胞的侵袭能力。随后采用荧光素酶报告基因系统和细胞免疫荧光评估TNF-α对核因子κB(NF-κB)的激活作用;蛋白质印迹分析检测IκBα及p-IκBα蛋白表达水平。TNF-α联合应用NF-κB抑制剂后,检测细胞EMT表型变化。结果 Hep3B和SMMC-7721细胞用TNF-α处理后,表现EMT的表型;细胞的划痕愈合率明显大于未处理组(P<0.05),Tr-answell实验显示细胞穿透膜的数量亦显著增多(P<0.05)。TNF-α能有效激活NF-κB报告基因,促进NF-κB p65核转位及IκBα的磷酸化。应用NF-κB抑制剂BAY11-7082能够逆转TNF-α诱导EMT的作用(P<0.05)。结论 TNF-α通过NF-κB依赖性途径诱导肝癌细胞发生EMT,进而促进肝癌的侵袭转移。

磷酸腺苷激活的蛋白激酶在慢性应激诱发小鼠非酒精性脂肪肝中的作用

目的探讨磷酸腺苷激活的蛋白激酶(AMPK)及其激动剂5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸(AICAR)在慢性应激诱发小鼠非酒精性脂肪肝(NAFLD)中的作用。方法建立小鼠慢性应激模型,设对照组、应激组、应激加AICAR给药组和AICAR给药组,每组6只。采用ELISA法检测小鼠血浆促炎性细胞因子(肿瘤坏死因子α,γ干扰素)浓度,采用自动生化分析仪检测小鼠血浆丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、总胆固醇、三酰甘油、游离脂肪酸的水平,采用苏木精-伊红染色和油红O染色检测肝细胞脂肪变性,采用蛋白质印迹法检测肝组织AMPK蛋白表达;然后用AICAR处理慢性应激小鼠并检测上述指标的变化。结果慢性应激导致小鼠肝细胞脂肪变性,肝功能损害(ALT、AST水平升高,P<0.01),血浆促炎性细胞因子浓度升高(P<0.05),血浆游离脂肪酸水平升高(P<0.01)以及肝组织AMPK蛋白表达降低(P<0.01)。AICAR改善了肝细胞脂肪变性,并缓解了上述指标的变化。结论慢性应激可能通过AMPK信号通路诱发NAFLD,AMPK激动剂AICAR可缓解慢性应激导致的NAFLD。

肝星状细胞条件培养基对肝癌细胞PLC／PRF／5耐药性的影响及其机制

目的:探讨肝星状细胞条件培养基(hepatic stellate cell conditioned medium,HSC-CM)对人肝癌PLC/PRF/5细胞耐药性的影响及其可能的机制。方法:用无血清RPMI 1640培养肝星状细胞LX-2,使其在缺营养的环境下活化,收集其条件培养上清即为HSC-CM。PLC/PRF/5细胞在HSC-CM条件下培养24 h后,顺铂处理12 h或24 h,采用流式细胞术检测PLC/PRF/5细胞的凋亡情况,MTT法检测PLC/PRF/5细胞的增殖,real-time PCR检测PLC/PRF/5细胞上皮间质转化(epithelialmesenchymal transition,EMT)相关基因的表达水平。结果:顺铂组12和24 h两个时间点PLC/PRF/5细胞的凋亡率为(22.34±1.12)%和(26.78±1.56)%;HSC-CM+顺铂组细胞的凋亡率为(17.22±1.42)%和(21.52±1.76)%,顺铂组细胞凋亡率显著高于HSC-CM+顺铂组(P<0.05)。同在这两个时间点,顺铂组和HSC-CM+顺铂组PLC/PRF/5细胞的增殖活性分别为(68.65±2.56)%和(79.47±1.43)%,(46.54±3.65)%和(62.77±2.89)%,HSC-CM+顺铂组细胞增殖活性均高于顺铂组(P<0.05)。Real-time PCR结果显示,与顺铂组相比较,HSC-CM+顺铂组PLC/PRF/5细胞中上皮标记物钙黏蛋白(E-cadherin)的表达下降(P<0.05),而间质细胞标记物神经黏附素(N-cadherin)、波形蛋白(vimentin)以及EMT相关转录因子Snail和ZEB1的表达显著上调(P<0.01)。结论:HSC-CM可能通过诱导PLC/PRF/5细胞发生EMT,从而增强PLC/PRF/5细胞对顺铂的抵抗作用。