多重RT-PCR用于临床检测三种胃肠炎病毒的研究

轮状病毒、诺瓦克病毒和星状病毒是引起病毒性胃肠炎的主要病原因子。研究采用JV12/JV13、P1/P2和Mon340/Mon348三对引物,建立了同时检测这3种病毒的多重RT-PCR技术,并应用于128份临床粪便样本的检测,检出轮状病毒62份(48.44%),诺瓦克病毒8份(6.25%),星状病毒11份(8.59%)。在灵敏度试验中,轮状病毒的检测灵敏度为5pg/mL、诺瓦克病毒和星状病毒的检测灵敏度均为50pg/mL。该研究所建立3种常见胃肠炎病毒的多重RT-PCR方法具有特异性强、灵敏度高的特点,可用于临床病原诊断和溯源。

水体中病毒浓缩方法及其条件优化

本研究探讨了在自来水和污水两种不同的水体环境中,三氯化铝沉淀法和正电荷滤膜法浓缩回收病毒的效率,并比较应用不同的浓缩条件、洗脱物质时的病毒回收率,从而建立有效的环境样本中病毒的浓缩方法。结果表明,三氯化铝沉淀法在两种水体中的回收率均较高,最高回收率分别达到96.0%和92.0%,但正电荷滤膜法在两种水体中的回收率差别较大。在自来水中,正电荷滤膜法的最高回收率为93.9%,在污水中的最高回收率仅为69.9%,这说明正电荷滤膜法适用于病毒含量较高且悬浮物等杂质较少的样本。在应用于自来水样时,两种方法均可起到有效的病毒浓缩作用,但在悬浮物等杂质较多的污水中,三氯化铝法具有较好的回收效率。

水体中诺瓦克病毒RT-PCR检测研究

诺瓦克病毒是公认的食源性或水源性非细菌性胃肠炎的主要致病因子之一。建立诺瓦克病毒的RT-PCR检测方法,验证其特异性及灵敏度,并在实验室人工污染水样,进行模拟水样的检测,验证RT-PCR检测方法的实用性。所用引物为RNA多聚酶区的JV12/JV13,多次反复实验,均可产生327bp预期大小的特异条带,并通过杂交进一步证实了其特异性和正确性;在临床粪样中,可达到的最高检测限为50pg/mL。在共42份模拟样品的检测中,经过播毒、富集和浓缩,38份均可检出诺瓦克病毒。其中4份池塘水未检出。在模拟水样中的检测灵敏度为200pg/mL。实验中所建立的试验条件和体系可用于实际水样中诺瓦克病毒的筛选,对水质控制起到了很好的监控作用。

轮状病毒NASBA检测研究

轮状病毒是世界范围内流行性胃肠炎暴发的重要病因。以患者粪便为样抽提轮状病毒RNA,在轮状病毒VP7高保守基因区段上设计引物,运用核酸序列依赖的扩增(NASBA)法进行检测,变性琼脂糖凝胶电泳和Northern杂交验证。NASBA预期的特异性产物为392bp,并在仅以目标核酸为模板或在浓度高达1μg/μL的非特异性核酸存在的混合模板中,均有清晰的目标带产生,表现出了很高的特异性。其灵敏度和RT-PCR相同甚至更高,可检测到50pg的核酸,并且当反应时间为3h时检测灵敏度最高。NASBA法扩增效率高、灵敏度高、快速易操作,尤其适用在基层单位推广应用。

自体DC-CIK细胞联合微波热凝治疗肝癌的疗效观察

目的:观察自体DC-CIK细胞联合经皮微波热凝(percutaneous microwave coagulation therapy,PMCT)治疗肝癌的临床疗效。方法:收集2012年1月至2014年2月东方肝胆外科医院生物治疗科收治的44例行PMCT+DC-CIK治疗的肝癌患者(联合治疗组),先行血细胞分离单采并进行DC-CIK细胞培养,采血后第2天进行PMCT治疗;培养10 d后行CIK细胞回输及DC疫苗皮内注射。此后分别于1、2个月后行第2疗程及第3疗程DC-CIK细胞治疗。同时选取44例单纯行PMCT治疗的同期肝癌患者与之配对(对照组),该组患者仅行PMCT治疗。观察两组治疗前后的AFP变化、免疫功能、无进展生存期、总生存期及不良反应。结果:联合治疗组、对照组治疗后均有AFP下降及外周血调节性T细胞降低,但联合治疗组下降程度更显著(P<0.05);对照组治疗后外周血淋巴细胞亚群无明显变化(P>0.05),而联合治疗组则显著升高(P<0.05)。联合治疗组中位无进展生存时间及中位总生存时间均较对照组延长(7.1 vs 4.9个月;21.5 vs 14.0个月,均P<0.05)。结论:自体DC-CIK细胞联合PMCT是治疗肝癌的一种有效方法,可提高患者免疫功能、延缓肿瘤复发、延长生存期,且不良反应较少。

单管半套式RT-PCR法检测贝类中轮状病毒的研究

轮状病毒(Rotavirus)是一种以贝类为载体的重要食源性病毒,目前来说,RT_PCR是贝类中轮状病毒最有效的检测方法,但通常由于病毒含量较低以及贝类中存在大量的PCR抑制物,致使将其运用于实际样本的检测时灵敏度仍较低。在实验室模拟自然环境,以人工播毒的方式使贝类富集轮状病毒,运用单管半套式RT_PCR法进行检测,并将单管半套式RT_PCR与ELISA、RT_PCR的检测灵敏度做了比较,表明单管半套式RT_PCR比ELISA的灵敏度高10 0 0倍,是传统RT_PCR的10倍,有时甚至10 0倍。另外,单管半套式RT_PCR法降低了实验过程中的内源性和外源性污染,使检测所需时间从6h缩短至4 5h ,大大改进和完善了食源性病毒检测方法。并同时以整只贝和仅以贝的消化道为样检测表明,以消化道为样时的病毒检出率和检测灵敏度较高。

自体树突状细胞疫苗联合细胞因子诱导的杀伤细胞治疗胆系肿瘤的临床疗效观察

目的观察自体树突状细胞（DC）疫苗联合细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK细胞）治疗胆系肿瘤的临床疗效。方法采集患者外周血单个核细胞,采用多种肿瘤抗原刺激后进行扩增和培养,收获成熟DC制成疫苗进行皮内注射,同时联合自体CIK细胞静脉回输,观察85例胆系肿瘤患者治疗前后的临床疗效、免疫功能、不良反应及生存时间。结果 85例胆系肿瘤患者经自体DC-CIK细胞治疗后,临床症状较前明显改善（P〈0.05）;临床疗效显著,完全缓解2例（2.3%）、部分缓解14例（16.5%）、疾病稳定54例（63.5%）及疾病进展15例（17.6%）;免疫功能提高,治疗后淋巴细胞亚群中CD3＋、CD3＋CD4＋、CD3＋CD8＋、CD3＋CD56＋及CD4＋/CD8＋比值升高,而调节性T细胞降低（P〈0.05）。至随访结束,58例患者死亡,2例失访,25例存活,中位生存期为16.5个月（95%CI：12.1-20.9个月）。结论自体DC-CIK细胞治疗是胆系肿瘤患者一种安全有效的治疗方法,不良反应少,但相关结论仍有待进一步大样本随机对照研究证实。

循环肿瘤细胞药物敏感性指导的化学治疗在晚期胆系肿瘤中的临床疗效

目的观察循环肿瘤细胞(CTC)药物敏感性指导的化学治疗在晚期胆系肿瘤中的临床疗效和安全性。方法收集2018年7月至2020年4月海军军医大学(第二军医大学)东方肝胆外科医院肿瘤生物治疗科收治的26例晚期胆系肿瘤患者,抽取患者外周血分离和富集CTC,用胆系肿瘤中常用的固定化学治疗方案进行药物敏感性检测,选取最佳方案对患者进行化学治疗(CTC组)。选择同期19例行GEMOX方案(吉西他滨+奥沙利铂)化学治疗的晚期胆系肿瘤患者作为对照(GEMOX组)。观察两组患者化学治疗后的客观缓解率(ORR)、疾病控制率(DCR)、无进展生存期(PFS)、总生存期(OS)及安全性。结果所有患者均可评价疗效与安全性,CTC组完全缓解1例,部分缓解4例,疾病稳定12例,疾病进展9例;GEMOX组部分缓解1例,疾病稳定10例,疾病进展8例。CTC组和GEMOX组患者的ORR分别为19.2%(5/26)和5.3%(1/19),DCR分别为65.4%(17/26)和57.9%(11/19)。CTC组患者的中位PFS为5.8个月(95% CI 4.5~7.2个月),GEMOX组为5.1个月(95% CI 4.6~6.4个月),差异无统计学意义(P=0.313)。CTC组患者的中位OS为13.6个月(95% CI 10.8~16.3个月),GEMOX组为7.9个月(95% CI 5.5~10.3个月),差异有统计学意义(P=0.003)。所有患者中,主要不良反应有贫血、中性粒细胞减少、血小板减少、乏力及厌食,均可耐受,且无治疗相关性死亡。结论 CTC药物敏感性指导的化学治疗提高了晚期胆系肿瘤反应率,延长了患者总生存期,且不良反应可耐受。CTC药物敏感性检测可操作性强,对临床准确选择个体化化学治疗方案有一定的指导价值,值得进一步推广。

食源性病毒及其检测方法

食源性病毒是指以食物为载体,导致人类发生疾病的病毒。按照病毒的不同来源,食源性病毒可分为肠道食源性病毒和人畜共患的食源性病毒两大类,肠道食源性病毒包括以粪便直接或间接污染食物,通过粪口途径使病毒传播给人类的病毒;人畜共患的食源性病毒是指一些人畜共患,以畜禽产品为载体传播的病毒。本文阐述了食源性病毒的种类、生物学特性、流行病学特征、研究现状,阐明了近年来以PCR为基础的分子生物学检测方法及存在的问题,提出了食源性病毒今后进一步研究的发展方向及实际应用前景。

水体污染中常见致病菌的多重PCR分子检测研究

[目的]建立同时检测沙门氏菌、志贺氏菌、绿脓杆菌、肠出血型大肠杆菌和副溶血弧菌等5种水体常见致病菌的多重PCR检测技术,为这些致病菌感染的快速诊断提供实验依据。[方法]筛选设计5对特异引物,建立优化的多重PCR扩增体系和条件。[结果]对5种致病菌的检测,多重PCR灵敏度分别为:肠出血型大肠杆菌O157102 cfu、志贺氏菌102 cfu、副溶血弧菌102 cfu、绿脓杆菌101 cfu、沙门氏菌102 cfu。应用于人工污染水样及天然水样的检测,均有清晰、特异的预期条带产生,并与传统检测结果一致,每个样品所需时间为6～8 h,相对于传统检测方法,极大地缩短了检测时间,提高了检测灵敏度。[结论]该方法适用于大通量样品的检测研究,可推广应用于食品检测、环境监测等领域。

诺瓦克病毒研究进展

诺瓦克病毒(Noroviruses,NVs)是1972年在美国首次发现的新生病毒,到1995年国内才有报道。该病毒是严重危害人类健康的重要食源性病毒,可导致不同年龄阶段人群的急性病毒性腹泻。因为至今没有发现合适的细胞系和动物模型用于NVs的体外增殖,所以对于该病毒的研究相对滞后。随着分子生物学及其他学科的不断发展,不同类群NVs全基因组测序完成并且病毒核衣壳蛋白分别获得真核和原核系统体外表达,从而对该病毒特性产生了一些新的认识和观点。论文从NVs的基因组结构与功能、蛋白质组成与功能、检测方法应用与发展和流行病学积累四个方面,系统介绍了该病毒国内外的研究现状以及其中存在的问题;其中,其蛋白质研究及其检测方法成为NVs的热点。论文还对NVs分子进化、检测技术和病毒体外增殖模式等提出不同的看法和建议。

水体病毒钙离子絮凝浓缩新方法研究

研究建立了一种从水体中浓缩病毒的新方法,即钙离子絮凝-柠檬酸缓冲液洗溶法,该方法的要点是先用一定量的钙离子溶液和钙离子絮凝剂絮凝水体中的病毒,再用pH5.0的0.3mol/L的柠檬酸缓冲液洗溶,然后再进一步超滤浓缩。此法可方便地将水体中的病毒浓缩10000倍以上。应用该法分别对人工播种于饮用水中的f2噬菌体和脊髓灰质炎疫苗病毒(PV1)进行了浓缩,结果发现f2噬菌体的平均回收率达96%,而PV1的回收率为100%,均显著高于阳电膜过滤法(P<0.05)。该方法快速、简便、有效。

饮用水中5种致病菌多重PCR技术检测研究

沙门氏菌(Salm onellasp.)、志贺氏菌(Shigellasp.)、绿脓杆菌(Pseudom onasaeruginosa)、肠出血型大肠杆菌O157(E terohaem orrhagicO157)和副溶血弧菌(Vibrio rah-aem olyticus)是5种饮用水中不得检出食源性致病菌,根据它们的毒素基因、高度保守基因及特异性基因,设计合成5对寡核苷酸引物,应用PCR技术对10个属的30株细菌进行引物特异性检测。通过对多重PCR反应体系、条件进行优化,显著提高了检测灵敏度。初步应用于水样分析中,极大的缩短了检测时间、降低了成本。实验结果表明:5对寡核苷酸引物都具较高的特异性和专一性,多重PCR检测灵敏度达到101~102cfu,检测需5~6h,在水样检测的初步应用中得到了均一、稳定、清晰的结果,可推广应用于环境监测、水源检测、食品卫生监督、商品检验检疫等领域。

诺瓦克病毒ORF2的原核表达及其产物分析

诺瓦克病毒(Norovirus,NV)是1972年在美国首次发现的新生病毒,直到1995年国内才有报道。该病毒是严重危害人类健康的重要食源性病毒,可导致不同年龄阶段人群的急性病毒性腹泻。实验以提取临床NV阳性腹泻样本的基因组RNA为模板,采用RT-PCR方法扩增得到全长为1623bp编码NV主要衣壳蛋白VP1的ORF2全基因序列。将测序结果进行进化分析,结果表明该病毒属于NVGII。将ORF2亚克隆到原核表达载体pET-28a构建原核表达载体,鉴定后转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。经IPTG诱导表达,获得大小约62kD的融合蛋白并命名为rVP1。以纯化的rVP1免疫新西兰大白兔后制备高免血清,WesternBlot结果表明,实验所获得的多克隆抗体可以特异性识别临床样本中NVVP1。因此,rVP1具有良好的免疫原性和反应原性。对小于rVP1的蛋白条带进行WesternBlot分析,结果表明所有条带均为rVP1的部分蛋白。双向琼脂扩散试验结果显示实验所获得的高效价多克隆抗体与纯化的原核表达产物仅形成单一沉淀带。

不同耐药性鲍曼不动杆菌耐药特征及常见耐药基因检测分析

目的比较不同耐药性鲍曼不动杆菌耐药特征和耐药基因特点。方法菌株经VITEK2 Compact全自动微生物分析系统进行鉴定和药敏分析,应用PCR法检测常见耐药基因(TEM、PER、gyrA、parC、armA、adeB)和生物膜基因(AbaI、Csu E、Csu C、Csu D、Omp A、bla-PER1、surA1、Pld、paaE)。结果共获得110株鲍曼不动杆菌菌株,多重耐药菌(42株)和泛耐药菌(43株)中耐药率最低的均是替加环素,分别为11.9%和4.7%。耐药基因TEM、armA、adeB检出率在多重耐药菌和相对敏感菌间比较,差异有统计学意义(P<0.05)。耐药基因TEM检出率在泛耐药菌和相对敏感菌间比较,差异有统计学意义(P<0.05)。耐药基因gyrA、armA、adeB检出率在多重耐药菌和泛耐药菌间比较,差异有统计学意义(P<0.05)。生物膜基因除bla-PER1基因外,其余基因的检出率在所有菌株中均较高(>65.0%),而多重耐药菌和泛耐药菌的paaE基因检出率明显高于相对敏感菌,差异有统计学意义(P<0.05)。结论临床分离的鲍曼不动杆菌耐药性严重,携带多种耐药基因是菌株产生耐药性的重要原因;paaE生物膜基因的携带可能在菌株多重耐药和泛耐药中起一定作用。

程序死亡受体1抗体治疗18例晚期肿瘤患者的临床疗效观察及文献复习

目的观察程序死亡受体1(programmed death-1,PD-1)抗体治疗晚期肿瘤患者的免疫疗效。方法选取东方肝胆外科医院生物治疗科2015年10月至2016年3月的18例晚期肿瘤患者,给予PD-1抗体静滴治疗。观察患者治疗前后的临床疗效、不良反应及无进展生存期,并对治疗前后患者的生活质量进行对比。结果患者经PD-1抗体治疗后,PR 5例、SD 7例、PD 6例,生活质量KPS评分较治疗前明显上升(P<0.05)。至随访结束,共有5例死亡,2例失访,11例存活,中位无进展生存期为2.6个月(95%CI:1.8~3.3个月),无严重不良反应和化验指标异常。结论 PD-1抗体是治疗晚期肿瘤安全有效的治疗方法,不良反应少,临床耐受良好,但该结论仍有待进一步大样本随机对照研究证实。

河网地区水环境治理案例分析

以广东某地区水环境治理为案例,从水环境问题识别、整治思路与措施、建设模式3个方面进行总结和分析。针对片区内的水体污染严重、潮汐现象明显、管网覆盖率低、河道被侵占等问题,提出控源截污、内源治理、活水循环、生态修复的技术路线。通过模型分析,在上述措施实施后,河道的水力条件明显改善,水质状况明显提升。同时,结合水环境整治的特点,分析EPC+O的运营模式在水环境治理中的作用。

顶拉管工艺在河涌截污工程中的应用

介绍了顶拉管工艺的原理和施工流程,对比分析了顶拉管和其他常用污水管道铺设工艺的适用条件。并将顶拉管工艺应用于中山市某镇沿河岸敷设的截污工程中,解决了河岸边工作面受限、地下水位高等技术问题,最大限度降低了施工过程对河涌周边环境的破坏,保证了施工的安全,减少了对居民生活及出行的影响。

基于Bayesian-LSSVM和残差修正的用户短期需水量预测

为有效改善供水管网短期需水量预测模型在预测精度和稳定性方面存在的不足,提出在短期需水量预测模型基础上叠加残差预测模型的组合预测建模方法.首先采用贝叶斯最小二乘支持向量机法(Bayesian-LSSVM)建立管网用户需水量时间序列预测模型(BL模型),得到需水量预测初始值;对BL模型得到的需水量预测初始值的残差序列,构建基于贝叶斯最小二乘支持向量机法的混沌时间序列预测模型(RM模型),得到残差预测值;同时将RM模型得到的残差预测值实时补偿到BL模型的需水量预测初始值中,得到经过残差修正的需水量预测值.实例结果表明,RM模型可以准确捕获BL模型需水量预测初始值的残差变化趋势,对其残差序列进行准确预测;在短期需水量预测的精度和稳定性方面,由BL模型和RM模型叠加构成的组合预测模型(BL+RM模型)明显优于单一BL模型;BL+RM模型适用于平均需水量较小、水量波动性较大等不同特点用户的短期需水量预测,可有效满足实际工程的需要.