反向DNA-pull down方法的建立

目的:建立反向DNA-pull down方法,验证目的蛋白与靶DNA的结合,为探究疾病发生发展的分子机制提供新的手段。方法:以小鼠骨髓来源巨噬细胞总cDNA为模板,通过PCR扩增获得转录因子PU.1-ETS结构域编码序列,通过酶切连接的方式连入表达质粒pET28a,转化至大肠杆菌BL21(DE3)诱导蛋白异源表达。以小鼠基因组DNA为模板,通过PCR获得Ly96启动子序列。将异源表达的PU.1 ETS结合至Ni-NTA磁珠后,与靶DNA—Ly96启动子体外孵育,最终经蛋白酶K酶解、DNA抽提及琼脂糖凝胶电泳检测PU.1 ETS体外结合Ly96启动子情况,评估反向DNA-pull down技术的可行性。结果:通过大肠杆菌异源表达和亲和纯化获得Ni-NTA磁珠-PU.1 ETS复合物,通过PCR获得Ly96启动子序列,经反向DNA-pull down验证PU.1 ETS与Ly96启动子的相互结合作用。结论:以PU.1-ETS-Ly96启动子相互作用为例,证实反向DNA pull-down技术的可行性,为探究已知蛋白与靶DNA结合和疾病发生发展分子机制提供了一种操作简单、实验条件要求不高、成本较低的可选方案。

C端截断的HBX突变体通过上调DR4和DR5表达促TRAIL诱导的肝癌细胞凋亡

目的探讨不同的HBX截断突变体对TRAIL-R1（DR4）和TRAIL-R2（DR5）表达的影响,以及DR4和DR5在HBX截断突变体增强TRAIL诱导的肝癌细胞凋亡中的作用。方法构建HBX的1~120 aa（C端截断）、51~120 aa（C端和N端共同截断）和51~155 aa（N端截断）的突变体表达载体HBX1、HBX2和HBX3;在HepG2和Huh-7肝癌细胞中,Real-time PCR和Western blot检测稳定转染HBX不同突变体的DR4和DR5的表达;Western blot检测RNA小干扰载体（DR4-siRNA和DR5-siRNA）的HBX突变体的DR4和DR5表达情况,流式细胞术检测TRAIL（200 ng/ml）诱导的肝癌细胞凋亡情况。结果经PCR扩增和双酶切鉴定,3种突变体表达载体HBX1、HBX2和HBX3重组质粒构建成功,测序检测目的基因序列正确;Real-time PCR和Western blot表明,HBX1能显著增加2种肝癌细胞系中的DR4和DR5基因和蛋白的表达;而HBX2和HBX3对DR4和DR5基因和蛋白的表达无显著影响;在Hep G2-HBX1和Huh-7-HBX1细胞中,与对照组相比,DR4-siRNA和DR5-siRNA显著降低了DR4、DR5的表达;流式细胞术检测结果显示HepG2-HBX1和Huh-7-HBX1细胞的凋亡率较对照组细胞均显著提高;RNA小干扰抑制DR4和DR5的表达后,HepG2-HBX1和Huh-7-HBX1细胞的凋亡率下降。结论成功构建了3种不同HBX突变体的真核表达载体;HBX基因C端截断（1~120 aa）的突变体能够上调DR4和DR5的表达,且能够上调DR4和DR5的表达促进TRAIL诱导的肝癌细胞凋亡。

徐州地区116株MRSA耐药性分析与分子流行病学调查

目的了解耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)感染现状和耐药机制,为临床合理用药提供依据。方法收集徐州地区2012—2015年各类标本中分离的金黄色葡萄球菌(SA),用头孢西丁纸片扩散法初筛MRSA菌株,扩增mecA基因进行确认,K-B法检测MRSA对药物的敏感性,E-test法测定万古霉素的最低抑菌浓度(MIC),采用多重PCR进行葡萄球菌染色体mec(SCCmec)基因分型。结果 2012—2015年210株SA共检出MRSA116株,其中mecA基因阳性114株,MRSA总检出率为55.24%。MRSA对万古霉素、奎奴普丁/达福普汀、替考拉宁和利奈唑胺的敏感率均为100%,对氯霉素和呋喃妥因的耐药率最低,分别为15.52%、1.72%,MRSA对10种抗菌药物的耐药率>80%;MRSA对青霉素类、氨基糖苷类、红霉素、喹诺酮类、磺胺类、利福平、四环素、克林霉素的耐药率高于甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(MSSA)。2012—2015年万古霉素对MRSA的MIC均为1.0μg/mL,MIC90均为1.5μg/mL,2015年发现1株MRSA的万古霉素MIC为2.0μg/mL。116株MRSA分型结果显示,SCCmecII型11株(9.48%),SCCmecIII型85株(73.28%),SCCmecIV型4株(IVa和IVb型各2株,均为1.72%),未分型MRSA16株(13.79%),未检出SCCmecI和V型。结论 MRSA呈严重的多重耐药,对万古霉素MIC无漂移,临床MRSA分离株以SCCmecIII型为主,临床应采取感染控制措施,控制MRSA感染。

急性寒冷刺激诱导小鼠米黄色脂肪细胞形成方法的建立

目的:建立急性寒冷刺激诱导小鼠皮下米黄色脂肪细胞形成的方法。方法:连续3天每天4 h预冷刺激使小鼠适应寒冷环境,然后持续24 h进行急性寒冷刺激,诱导小鼠皮下脂肪中米黄色脂肪细胞形成。采用免疫组化检测皮下脂肪中Ucp1阳性细胞,荧光定量PCR检测米黄色脂肪细胞标志性基因Ucp1、Prdm16、Pgc1α、Cidea的转录,Western blot检测米黄色脂肪细胞标志性蛋白Prdm16和Ucp1的表达。结果:急性寒冷刺激后小鼠皮下脂肪中Ucp1阳性细胞数量明显增加,Ucp1、Prdm16、Pgc1α、Cidea转录明显上调,Prdm16、Ucp1蛋白表达明显升高。结论:本研究建立的急性寒冷刺激诱导小鼠皮下米黄色脂肪细胞形成的方法可靠,可用于米黄色脂肪细胞形成调控机制的研究。

儿茶素对脂肪前体细胞增殖和分化的影响

目的:探究儿茶素对脂肪前体细胞增殖的影响及其对脂肪前体细胞向白色和米黄色脂肪细胞分化的影响。方法:通过油红染色检测胞内脂滴形成情况。通过Western blot检测白色脂肪细胞标志性蛋白Pparγ、p-HSL、Perilipin 1及米黄色脂肪细胞标志性蛋白Prdm16和Ucp1,通过荧光定量PCR检测米黄色脂肪细胞标志性基因的转录。结果:儿茶素能够抑制脂肪前体细胞3T3-L1的增殖,抑制脂滴的形成,抑制白色脂肪细胞中Pparγ、p-HSL、Perilipin 1的表达,不影响米黄色脂肪细胞中Prdm16、Ucp1的表达。结论:儿茶素能够抑制脂肪前体细胞增殖,抑制脂肪前体细胞向白色脂肪细胞分化,但不影响脂肪前体细胞向米黄色脂肪细胞分化。

米黄色脂肪细胞诱导分化方法研究

目的建立米黄色脂肪细胞分化的方法并进行分析。方法通过诱导物刺激使脂肪前体细胞3T3-L1向米黄色脂肪细胞分化。细胞分化完成后经油红染色检测胞内脂滴的形成,经荧光定量PCR和Western blot检测米黄色脂肪细胞标志性蛋白Pparγ,Prdm16和Ucp1的表达,确定分化成熟的细胞是米黄色脂肪细胞。经转录测序分析脂肪前体细胞和米黄色脂肪细胞差异表达基因及KEGG pathway富集情况。结果采用本研究中的诱导分化方法得到的分化细胞油红染色阳性,米黄色脂肪细胞标志性蛋白Pparγ、Prdm16、Ucp1均高表达,转录测序显示分化后细胞与未分化细胞基因表达差异较大。结论本研究建立的米黄色脂肪细胞分化的方法准确可靠,可用于米黄色脂肪细胞形成调控机制等研究。

充分利用医学教育资源提高生物类专业微生物学教学质量的思考

微生物学是高等院校生物类专业的专业基础课,具有涉及面广、实用性强及发展迅速等特点,同时也是其他生物学理论和课程的基础,其教学质量对生物专业人才培养具有重要影响。徐州医科大学生物类专业是一门新开专业,如何结合医学院校自身教育优势及生物类专业特点和发展要求,努力探索一套科学合理、具有医学院校特色的微生物学教学体系,是目前医学院校生物类专业微生物教学的重要议题之一。

SOCS3基因3’端非翻译区野生型与突变型载体的构建及活性鉴定

目的研究非编码小RNA-1896（miRNA-1896）和miRNA-409—3p对细胞因子信号抑制蛋白-3（suppressors of cytokinesignaling-3，SOTS3）基因的调控作用，构建floes3基因3’端非翻译区（3’-untranslated re-gion，3’-UTR）野生型和突变型重组荧光素酶报告载体。方法以原代培养的小鼠星形胶质细胞总eDNA为模板，通过点突变和缺失突变的方式分别对SOCS33’-UTR序列中miRNA-1896和miRNA-409—3p种子区的结合位点CAGAGA（897—902位）和AACATT（1425—1430位）进行突变，并将野生型的3’-UTR序列与突变的3’-UTR序列分别插入到虫荧光素酶表达质粒pGL3-Promoter获得重组质粒，命名为pGL3-SOCS3-WT、pGL3-SOCS3-M1和pGL3-SOCS3-M2。将上述重组质粒分别与miRNA-1896和miRNA-409—3p共转染至HEK293T细胞中，测定虫荧光素酶的活性。结果酶切验证及测序结果表明，重组质粒pGL3-SOCS3-WT、pGL3-SOCS3-M1和pGL3-SOCS3-M2构建成功。与对照组相比，转染miRNA-1896和miRNA-409—3p均显著降低了pGL3-SOCS3-WT虫荧光素酶的活性，但对pGL3-SOCS3-M1和pGL3-SOCS3-M2荧光素酶的活性并无明显影响。结论成功构建了soc33’-UTR野生型及突变型的虫荧光素酶重组表达质粒，确认CA-GAGA（897—902位）和AACATr（1425—1430位）分别是miRNA-1896和miRNA-409—3p种子区与socs33’-UTR结合的关键位点。

酵母双杂交文库筛选HBX相互作用蛋白

目的:筛选鉴定新的乙肝病毒X蛋白(hepatitis B viral X protein,HBX)相互作用蛋白。方法:以HBX为诱饵蛋白,将其与酿酒酵母转录因子GAL4 DBD(DNA binding domain)融合表达,将人肝脏cDNA文库编码的蛋白与GAL4的AD区(activation domain)融合表达。通过酵母双杂交筛选鉴定肝脏中与HBX相互作用的蛋白。筛选得到的阳性酵母转化子,经质粒提取和测序后,分析其所包含的序列编码的蛋白,通过再次验证,初步确定该蛋白是否与HBX具有相互作用。结果:筛选得到5个潜在的能与HBX相互作用的蛋白。结论:通过酵母双杂交c DNA文库筛选,得到多个潜在的HBX相互作用蛋白,进一步的验证及功能研究将对揭示HBX促进肝癌发生的机制起到重要的推动作用。

可溶型小鼠细胞因子LIGHT/TNFSF14的原核表达、纯化及活性验证

目的:前期研究发现小鼠细胞因子LIGHT(TNFSF14)能够抑制脂肪前体细胞分化,表达纯化LIGHT并验证其活性,将为进一步明确其调控脂肪前体细胞分化的机制提供坚实的基础。方法:以小鼠脾脏总cDNA为模板,通过PCR扩增得到LIGHT胞外段编码序列,并将其克隆至pGEX4T-1,经菌液PCR、限制性内切酶酶切及测序验证后获得重组质粒pGEX4T-1-LIGHTc。重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导蛋白表达后SDS-PAGE检测菌体破碎液上清中可溶型LIGHTc的存在。含有重组蛋白的上清经亲和纯化后获得GST-LIGHTc重组蛋白,重组蛋白经凝血酶消化后得到游离型LIGHTc单体,最后通过结肠癌细胞生长抑制实验验证LIGHTc单体的活性。结果:通过大肠杆菌异源表达和亲和纯化获得了GST-LIGHTc重组蛋白,经凝血酶处理后得到有活性的游离型小鼠LIGHT蛋白。结论:通过大肠杆菌异源表达及亲和纯化获得有活性的小鼠LIGHTc重组蛋白,为进一步研究LIGHT影响脂肪前体细胞分化的分子机制奠定了重要的材料基础。

106株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药性分析与SCCmec基因分型及pvl基因研究

目的研究医院感染分离的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)耐药性,对葡萄球菌染色体mec(SCCmec)基因进行分型,并检测杀白细胞素(PVL)毒力基因,以明确MRSA耐药表型和流行病学特征,为临床治疗提供参考。方法收集2011-2014年金黄色葡萄球菌(SAU)179株并鉴定出MRSA,采用K-B法进行耐药表型检测,多重PCR进行SCCmec基因分型,普通PCR检测pvl基因携带情况。结果 179株SAU中共鉴定出106株MRSA,检出率为59.2%;MRSA对万古霉素、喹奴普汀/达福普汀、利奈唑胺和替考拉宁耐药率为0,对利福平、磺胺甲噁唑/甲氧苄啶和呋喃妥因的耐药率分别为43.4%、21.7%和4.8%,对其他抗菌药物耐药率均>50.0%;106株MRSA被分为3个型别,其中SCCmecⅢ型77株(72.6%),SCCmecⅡ型11株(10.4%),SCCmecⅣ型2株(1.9%),未分型16株(15.1%);4株MRSA被检出pvl基因阳性,携带率为3.8%。结论 MRSA总体呈严重的多药耐药性,未发现万古霉素耐药株;临床MRSA分离株以SCCmecⅢ型为主,Ⅱ型次之;应重点关注携带pvl基因的SCCmecⅢ型多药耐药MRSA株。

微小巴贝斯虫烯醇化酶蛋白主要特征与抗原表位的生物信息学分析

目的运用生物信息学方法分析微小巴贝斯虫烯醇化酶(BmEno)基因编码蛋白的主要特征和抗原表位。方法运用ORF Finder、PROSITE、ProtPar am、SignalP、TMpred、SOSUI、MotifScan、Bcepred、HNN等生物信息学在线分析软件,结合DNASTAR生物信息学分析软件,预测BmEno蛋白的开放阅读框、特征结构域、理化性质、信号肽、跨膜区、翻译后修饰位点、可溶性、亲水性、表面可及性、二级结构和抗原表位。结果该蛋白由438个氨基酸组成,在349-362位存在烯醇化酶的特征结构域,分子式为C_(2098)H_(3366)N_(570)O_(648)S_(18),分子质量单位为47.5203ku,等电点理论值为5.98,有25个翻译后修饰位点,10个亲水性参数得分≥1.9的区域,6个柔韧性参数得分≥2.0的区域,18个表面可及性参数得分≥1.9的区域,7个潜在的B细胞抗原表位,15个潜在的T细胞抗原表位,为可溶性蛋白。结论微小巴贝斯虫烯醇化酶蛋白为可溶性蛋白,有多个抗原表位,具有潜在的免疫原性,可以作为微小巴贝斯虫的疫苗候选抗原。