具长效性重组人血清白蛋白/粒细胞刺激因子融合蛋白的理化特性研究

目的对符合制药要求的高纯度重组人血清白蛋白/粒细胞刺激因子融合蛋白原料药开展理化特性研究。方法利用基因工程技术构建了可高效表达重组人血清白蛋白/粒细胞刺激因子融合蛋白(rHSA/GCSF)的毕赤酵母工程菌,rHSA/GCSF直接分泌到组分简单的无机盐培养基中,而后经特别建立的高效分离纯化工艺进行分离纯化。通过理化分析手段,首次获得rHSA/GCSF的多项理化特性指标和结果。结果 rHSA/GCSF原料药的蛋白质纯度达到98%以上;肽质量指纹图谱匹配率为84%;N-端氨基酸序列前15个氨基酸与理论序列相符;质谱分子量测定结果为85305D,与理论分子量85215D值相近;自由巯基含量为2.4;融合蛋白经圆二色光谱分析比对表明HSA和GCSF各自的空间构象未变;等电点(pI)约为5.8;融合蛋白为非糖基化蛋白、紫外光谱呈现典型蛋白质光谱;原料药中的细菌内毒素、宿主蛋白质、外源性DNA、甲醇和甘油的残留量符合作为药物的要求。融合蛋白的免疫学鉴别为阳性;体外细胞学生物比活性测定结果值为1.5×107IU/mg,与单体rGCSF的等摩尔比没有显著差异。结论研究获得的方法和结果可作为指导《注射用重组人血清白蛋白/粒细胞刺激因子融合蛋白》原料药的质量标准和制检规程的基础。

具创新分子结构的更优长效性重组人血清白蛋白/促红素融合蛋白的表达、制备和特性研究

目的研究作为药物级别重组人血清白蛋白/促红素融合蛋白的生产制备工艺;开展详尽的融合蛋白理化特性研究;提出作为长效创新药物的质量基础和技术指标。方法利用基因工程技术构建1个能稳定表达全新分子结构和更优长效性的重组人血清白蛋白/促红素融合蛋白(rH SA/EPO)的基因工程CHO细胞株;研究建立悬浮、无血清培养基,批次化、可线性放大的规模化生产工艺,并就分离纯化的融合蛋白进行详尽的理化特性分析。结果获得的r HSA/EPO蛋白质单体纯度达到97%以上;经不同作用位点蛋白酶水解的r HSA/EPO产物通过MALDI-TOF/TOF质谱肽质量指纹谱和Nano LC-MS/MS液质联用串联质谱检测得到总序列覆盖率100%;N-端氨基酸序列前15个氨基酸与理论序列相符;rH SA/EPO为糖基化蛋白,定位了糖基化位点;原液中融合蛋白的质谱分子量测定值为93 k D;酶深度脱糖后的质谱分子量测定结果为84205 D,与理论分子量84849.52 D值相近;融合蛋白含有1个自由巯基,表明仅有1个游离半胱氨酸存在;经圆二色光谱分析比对表明,HSA和EPO各自的空间二级构象未变;毛细管电泳测定有多个电荷异构体范围在pI 5.1~5.8,等电聚焦获得的等电点值(p I)约为p I 4.9;紫外光谱呈现典型蛋白质光谱特征;原料药中的细菌内毒素、宿主蛋白质、外源性DNA的残留量均符合药物原料药的要求。免疫学鉴别为阳性;小鼠体内生物比活性测定结果值为0.9×105 IU/mg;体外UT7细胞法与小鼠体内生物活性测定较大差异,但体内与体外生物活性测定方法可用于不同试验目的,且相互间也具有一定的相关系数。结论理化特性研究获得较为全面的药学数据,其结果可作为指导"注射用重组人血清白蛋白/促红素融合蛋白(CHO细胞)"原料药的质量标准和制造检定规程的基础,并显示出原创的r HSA/EPO(之间无连接肽)具有创新性,符合作为药物的更优分子结构要求。

两种具长效性重组人血清白蛋白/干扰素α融合蛋白表达工程菌的构建及融合蛋白的理化特性研究

目的对两种长效干扰素α融合蛋白原料药的理化特性多项指标开展分析和进行比较。方法利用基因工程技术分别构建了可高效表达重组人血清白蛋白/干扰素α2a融合蛋白(rHSA/IFNα2a)或重组人血清白蛋白/干扰素α2b融合蛋白(rHSA/IFNα2b)的毕赤酵母工程菌。融合蛋白直接分泌到组分简单的无机盐培养基中,并经特别建立的高效分离纯化工艺进行纯化,随后对两个融合蛋白进行详尽的理化特性分析。结果获得的融合蛋白纯度在98%以上;N端前15个氨基酸序列与理论序列相同;质谱分子量分别为85640.8D和85781.5D;圆二色光谱分析比对蛋白空间构象未变;等电点pI约在5.1左右;为非糖基化蛋白;紫外光谱呈典型蛋白质光谱;自由巯基含量测定值为1.4;肽图批次间一致;肽质量指纹图谱可匹配分别达83%和82%;对制备的2个融合蛋白原料药中的细菌内毒素、宿主蛋白质、外源性DNA、甲醇和甘油的残留量检测符合标准要求;融合蛋白的免疫学鉴别为阳性;体外细胞生物比活性约为2.5×105IU/mg,并且2个融合蛋白生物比活性测定值无不同,由此,获得了符合临床用药标准的原料药。结论研究所获得的结果可以作为指导《注射用重组人血清白蛋白/干扰素α2a融合蛋白》和《注射用重组人血清白蛋白/干扰素α2b融合蛋白》2个新药的原料药生产质量标准的建立和检定方法的确定。