GRP78在全长丙肝病毒RNA转染细胞中表达的研究

目的用蛋白质组学的方法研究全长丙肝病毒RNA转染细胞的差异表达蛋白,观察差异表达蛋白GRP78的表达变化。方法提取全长丙肝病毒RNA转染Huh-7细胞和未转染Huh-7细胞总蛋白,进行双向凝胶电泳和MALDI-TOF质谱分析,鉴定差异表达蛋白。应用RTQ-PCR检测GRP78的相对表达量。结果经双向凝胶电泳和质谱鉴定,共发现54个差异表达蛋白,其中包括GRP78蛋白。RTQ-PCR检测结果显示,在转染初期GRP78基因转录显著上调,转染24 h的相对表达率是未转染细胞的2.104倍,后随时间推移逐步下调。结论建立了重复性较好、分辨率较高的全长丙肝病毒RNA转染细胞2D图谱。GRP78蛋白的显著差异表达提示GRP78蛋白在丙肝的发生和发展中起一定的作用。

慢性丙型肝炎患者血清prohibitin表达水平的检测

目的检测抗增殖蛋白(prohibitin,PHB)在慢性丙型肝炎患者血清中的表达水平,为探讨PHB在丙型肝炎病毒(HCV)致病机制中的作用提供临床资料。方法应用双抗体夹心法ELISA定量检测63例慢性丙型肝炎患者及30例正常体检者血清PHB浓度,同时检测丙型肝炎患者血清病毒滴度及肝功能指标。结果丙型肝炎患者及正常人血清PHB浓度分别为31.88 ng/L及76.94 ng/L,丙肝患者血清PHB含量明显低于正常人(U=344.00,P=0.000),丙肝患者肝功能指标天冬氨酸转氨酶(AST)、直接胆红素(DBIL)与PHB浓度呈负相关(r=-0.484,P=0.012;r=-0.446,P=0.022)。结论慢性丙型肝炎患者血清PHB含量低于正常人,并与肝损伤的严重程度呈负相关,肝损伤越重,PHB含量越低。

《生物信息学》教学实践探讨

从教学实际出发,总结了医学院校《生物信息学》教学实践中的一些体会,探讨了提高学生生物医学信息处理能力的教学模式、教学内容和方法。期望通过《生物信息学》课程的讲授,使学生了解到生物信息学发展的前沿,掌握生物信息学的基本分析方法,最终达到能够在科研中独立应用生物信息学进行分析的目的。

细胞角蛋白8真核表达载体的构建、表达及生物信息学分析

目的:构建人细胞角蛋白8(CK8)全长CDS序列真核表达载体,并转染人肝癌细胞SMMC7721,为研究CK8的生物学功能提供细胞模型。方法:RT-PCR扩增CK8全长CDS,克隆入pMD18-Tsimplevector质粒,鉴定正确后,亚克隆入质粒pEGFP-C1,构建真核表达载体pEGFP-CK8。脂质体介导转染SMMC7721细胞,荧光显微镜、realtimePCR和Westernblot检测CK8的表达。生物信息学软件分析CK8理化特性、信号肽及功能位点等。结果:PCR、酶切和测序结果均证实重组质粒含有人CK8全长CDS序列,转染实验表明CK8在SMMC7721细胞中发生了高表达。结论:成功地构建了人CK8全长CDS真核表达载体,并使其在SMMC7721细胞中获得高表达,为研究CK8的生物学功能奠定了实验基础。

棉铃虫核型多角体病毒泰国株ORF27全长基因序列分析及其截短型基因的原核表达

目的研究棉铃虫核型多角体病毒泰国株ORF27蛋白的功能,阐释其在传代效应中可能发挥的分子机制。方法用PCR方法从棉铃虫核型多角体病毒泰国株基因组中扩增ORF27基因;使用ProtParam、TMpred、SignalP、ScanProsite等生物信息学软件分析其理化特性、亚细胞定位、信号肽、跨膜结构、功能位点等;并将其氨基端截短型基因进行原核表达。结果ORF27基因序列全长768 nt,编码255 aa,分子质量约29.5 ku。生物信息学软件预测其具有多个功能基序。截短型重组载体表达出分子质量约35 ku的外源蛋白,主要以包涵体形式存在。结论棉铃虫核型多角体病毒ORF27蛋白可能具有非常广泛的生物学活性,调控多种细胞信号传导通路,调节细胞凋亡和细胞周期,参与传代效应的发生。

蛲虫感染与个人和社会因素的关系及其对儿童生长发育的影响

目的 探讨蛲虫感染与个人和社会因素的关系及其对儿童行为和体格发育的影响 ,为控制蛲虫病寻找更有效的途径。 方法 采用透明胶纸粘贴法对陕西省 11所城镇幼儿园的 6岁以下儿童进行蛲虫抽样检查 ,同时对儿童卫生习惯、父母知识水平、当地经济条件、幼儿园卫生状况、儿童临床症状、体格发育状况等方面进行问卷调查。 结果 陕西地区儿童蛲虫感染率为 15 .99% ,男性 (18.5 4% )高于女性 (12 .5 5 % ) ,陕南 (19.5 6 % )略高于关中 (15 .77% )和陕北(15 .2 8% ) ;蛲虫感染与儿童饭前便后不洗手、不常剪指甲、不洗澡、喝生水等不良卫生习惯呈正相关 ,而与父母亲 (尤其是母亲 )的文化程度、当地经济条件、幼儿园的卫生状况呈负相关 ;全托幼儿园儿童蛲虫感染率 (4 7.0 6 % )明显高于日托(14.14% )和散居儿童 (16 .6 7% ) ;感染蛲虫后 ,肛周瘙痒和夜间磨牙症状比较突出 ;轻中度感染对儿童的体格发育 ,如身高、体重、头围、胸围无明显影响 ,而重度感染组除头围外儿童的身高、体重、胸围明显低于对照组儿童。 结论 蛲虫感染与个人卫生习惯、父母文化程度和社会经济状况密切相关 ;长期重度感染可使儿童体格发育稍滞后于同龄人。

人体蠕形螨的DNA提取与随机引物PCR检测

【目的】探索人体毛囊蠕形螨和皮脂蠕形螨DNA的提取方法。【方法】采用液氮反复冻融研磨法破碎螨体细胞,选用改良小昆虫DNA提取法、碱裂解法和试剂盒提取法,分别提取冻存时间在5个月内和8～10个月的毛囊蠕形螨和皮脂蠕形螨基因组DNA,并用随机引物PCR方法进行检测。【结果】蛋白核酸测定仪检测结果显示,试剂盒法提取的DNA纯度较高、量较多,明显优于改良小昆虫法和碱裂解法。随机引物扩增结果显示清晰的DNA指纹图谱,两种人体蠕形螨DNA指纹具有明显差异。蠕形螨冻存时间影响DNA提取的量,但对DNA提取的纯度和RAPD指纹图谱影响较小。不同DNA提取方法提取的同一种蠕形螨DNA指纹图谱基本相似,试剂盒法和改良小昆虫法提取的DNA样本条带多而清晰,碱裂解法提取的样本条带少而模糊。【结论】液氮反复冻融研磨法破碎蠕形螨细胞是有效的,蠕形螨冻存时间不宜超过6个月,试剂盒提取法是提取蠕形螨DNA的好方法。RAPD技术可以用于这两种人体蠕形螨DNA分子水平上的检测和分类。

人体蠕形螨感染调查及相关因素分析

目的 探讨蠕形螨感染与集体生活、卫生习惯及痤疮、酒渣鼻等面部疾患的关系。 方法 采用透明胶带粘贴过夜和挤粘结合法对 2 13名在校大学生进行蠕形螨检查 ,同时对个人卫生习惯、皮肤类型及面部疾患等相关因素问卷调查。 结果 在校大学生蠕形螨总感染率为 49.3 % ,男性 (5 1.3 % )略高于女性 (4 7.0 % ) ;毛囊蠕形螨面部感染率高于皮脂蠕形螨 ;洗刷用品个人专用可降低蠕形螨感染率 ;油性皮肤或混合性皮肤学生蠕形螨感染率及患酒渣鼻、痤疮等面部疾患的概率均较高。 结论 蠕形螨感染与个人卫生习惯、皮肤类型密切相关 ;蠕形螨感染是痤疮、酒渣鼻等疾患的发病因素之一。

人体蠕形螨流行与致病性调查研究

目的:了解人体蠕形螨在大学生中的流行、分布情况及致病性。方法:采用挤压法和透明胶带法对西安市某校465名医学生蠕形螨的感染情况进行了检查和问卷调查。结果:大学生蠕形螨感染率为92.90%,以单纯毛囊蠕形螨感染为主;轻度感染多见;颊部感染率最高。不同性别、城乡以及皮肤类型间感染率均无统计学差异;但油、混性皮肤者中重度感染占39.93%,明显高于中、干性皮肤的25.00%。透明胶带法检出率明显高于挤压法。增加检查次数、扩大检查面积,均可提高检出率。蠕形螨感染有症状者高达54%(189/350)。皮肤科病人蠕形螨感染率高于普通调查学生。结论:大学生蠕形螨检出率与检查方法、检查次数、检查面积、检查部位和皮肤类型等多种因素有关;蠕形螨感染是痤疮、酒渣鼻、脂溢性皮炎等面部疾患的重要因素;目前市面上众多驱螨化妆品对蠕形螨的杀虫效果有待商榷。

丙型肝炎病毒非结构蛋白3全长基因的克隆和表达

目的克隆和表达丙型肝炎病毒(HCV)非结构基因NS3,为进一步研究其基因功能奠定基础。方法设计特异性引物,以HCV全长cDNA质粒为模板进行PCR扩增,获得全长NS3基因。将其插入克隆载体pMD18-Tvector中,经酶切、PCR及测序鉴定后,与表达载体pET32a重组,后转入BL21菌株并诱导表达。采用SDS-PAGE电泳及Western-blot检测NS3基因的蛋白表达水平。结果含有NS3的重组体构建成功并在大肠杆菌中表达。结论运用原核细胞基因工程技术成功构建和表达了HCV非结构基因NS3蛋白,为尽一步研究HCVNS3基因功能奠定了基础。

结核分枝杆菌链霉素耐药基因rpsL的检测

目的探讨结核分枝杆菌(TB)对链霉素(Sm)耐药的分子机制,建立快速检测结核分枝杆菌Sm耐药性的方法。方法应用聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)和聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术检测80株结核分枝杆菌临床分离株的rpsL基因。结果以H37Rv标准株为对照,21株敏感株中,1株(4.76%) SSCP和RFLP分析存在rpsL基因异常;59株耐药株中,36株(61.02%)SSCP和RFLP分析存在rpsL基因异常。结论结核分枝杆菌对Sm耐药与rpsL基因突变有关,PCR-SSCP和PCR-RFLP技术可快速、准确地检测结核分枝杆菌对Sm的耐药性。

HCV全基因组培养细胞的比较蛋白组学研究

利用比较蛋白质组技术研究了转染丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)全基因组的人肝癌细胞系Huh7细胞模型中蛋白质表达谱的变化,建立了Huh7-HCV的双向凝胶电泳蛋白质表达图谱和数据库.通过双向凝胶电泳分离和图像分析,对表达差异2倍以上蛋白质点进行了胶内酶解和MALDI-TOF MS鉴定.得到包括与细胞骨架蛋白、细胞周期、凋亡和信号转导等相关的14个蛋白质,并且用Western blot验证了热休克蛋白70的蛋白质组研究结果.利用HCV全基因组培养系统,采用蛋白质组学技术,为研究HCV病毒和宿主细胞相互作用提供了新的实验数据,为深入研究HCV病毒复制和分子致病机理奠定了基础.

抑制素在人肝癌细胞SMMC-7721和Huh-7中的表达及其编码序列扩增

目的检测抑制素在人肝癌细胞SMMC-7721及Huh-7中的基因表达,扩增抑制素全长编码序列。方法分别提取肝癌细胞SMMC-7721及Huh-7细胞总RNA,逆转录合成cDNA。使用Real time PCR,以GAPDH为内参检测抑制素的mRNA表达情况。采用RT-PCR方法扩增抑制素全长编码序列。结果 Real time PCR结果显示,SMMC-7721和Huh-7肝癌细胞株中均有抑制素的表达,且SMMC-7721细胞中抑制素表达量是Huh-7细胞中的6.652倍。RT-PCR方法扩增得到约835 bp的抑制素全长编码序列,条带特异,无非特异性扩增。结论人肝癌细胞株SMMC-7721中抑制素的表达量较高。

丙型肝炎患者血清蛋白质组差异表达的初步研究

目的观察丙型肝炎病毒(HCV)患者血清蛋白质组的变化情况,为研究丙型肝炎的发病机制及治疗提供新的线索。方法收集丙型肝炎患者和健康对照者血清,去除血清中高丰度蛋白;应用双向凝胶电泳技术构建2组研究对象血清二维电泳图谱,Image Master软件分析所得图谱,寻找差异蛋白质点;基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱法对2组间比较所得目标蛋白质点进行质谱鉴定。结果获得了HCV患者血清蛋白质双向电泳图谱,对表达差异2倍以上进行质谱鉴定,共鉴定出15种蛋白质。结论成功鉴定了15个HCV相关蛋白质,为进一步研究其发病机制及治疗手段提供了实验基础。

人细胞角蛋白8(CK8)基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的:克隆人细胞角蛋白8(CK8)基因cDNA并在大肠杆菌中表达CK8蛋白产物。方法:运用DNA重组技术,设计CK8基因特异引物,采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术从人肝细胞癌7721细胞中扩增CK8编码区cDNA,将其插入克隆载体pMD18-T simple vector中,获得重组质粒pMD18-CK8,转化感受态大肠杆菌DH5α。继而采用PCR技术从重组质粒pMD18-CK8中扩增出约1500bp目的片段,再次级克隆到原核表达质粒pET-28a(+)载体中,获得pET-28a-CK8重组原核表达质粒;经酶切、PCR及测序鉴定后转化入BL21(DE3)菌株,在IPTG诱导下进行融合蛋白的表达。采用SDS-PAGE电泳及Western blot检测CK8蛋白表达水平。结果:成功建立了人CK8基因cDNA重组体的无性繁殖系。②在原核细胞中成功地表达出人CK8蛋白,该蛋白具有很好的免疫原性。结论:运用原核细胞基因工程技术成功构建和表达了人细胞角蛋白8(CK8)基因,为进一步研究CK8的基因型及探讨该基因编码的CK8蛋白的性质和生物学活性创造条件。

抗增殖蛋白在宫颈鳞癌中的表达及意义

目的探讨抗增殖蛋白(PHB)在宫颈鳞状细胞癌(SCC)中的表达及意义。方法用免疫组化SP二步法检测了57例宫颈组织标本中PHB的表达,其中SCC 20例、宫颈上皮内瘤样病变(CIN)17例、慢性宫颈炎20例。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定50例血清标本中PHB的表达,其中SCC 14例,CIN 3级10例,正常人26例。结果免疫组化结果显示,PHB在SCC、CIN及慢性宫颈炎组织中的阳性率分别为75%、52.9%和15%,3组间的差异有统计学意义(P<0.05),且其阳性表达与宫颈病变程度呈正相关(rs=0.949,P<0.05);PHB在SCC、CIN患者和正常人血清中的质量浓度中位数分别为:31.41、28.53、76.94ng/mL,PHB在正常人血清中的表达显著高于其在CIN 3级及SCC中的表达(P<0.05)。结论 PHB在不同宫颈病变中存在差异表达,有可能成为宫颈癌的分子标志物。

丙型肝炎病毒研究模型的现状与未来

在过去较长时间内,由于缺少合适的丙型肝炎病毒研究模型,对丙肝病毒感染机制、生活周期和致病机制的研究进展较为缓慢。对丙肝病毒的认识不足严重阻碍了相关预防性疫苗和治疗药物的研制。近年建立的丙肝病毒全基因体外培养系统是一项重大突破,这将促进人们对丙肝病毒的全面认识和丙型肝炎防治药物的开发。

人类表皮生长因子受体2和β-联蛋白在食管癌中的表达及其意义

目的探讨人类表皮生长因子受体2(HER2)和β-联蛋白(β-catenin)在食管癌中的表达及意义。方法用免疫组织化学方法检测食管癌组织、远癌组织中HER2和β-catenin的蛋白表达。结果 HER2在食管癌组织中未见强阳性表达,β-catenin在食管癌组织中呈异常表达,二者在食管癌中的表达无明显相关关系。结论HER2在食管癌组织中有表达,但其表达强度未达到赫赛汀靶向治疗的标准;β-catenin在食管癌中有异常表达,提示其有可能在食管癌的发生发展中发挥重要作用,并可能成为判断食管转移及预后的指标之一,两者在食管中表达无明显相关性。

宫颈癌相关新癌基因hWAPL的原核表达和免疫原性分析

目的:构建hWAPL原核表达载体,诱导hWAPL蛋白表达并制备其多克隆抗体。方法:RT-PCR技术扩增hWAPL cDNA片段,连接到pMD18-T载体,测序正确后亚克隆入原核表达载体pET28a并转化BL21菌株,用SDS-PAGE电泳鉴定重组菌的诱导表达情况,制备hWAPL蛋白并免疫BALB/c小鼠,ELISA法测定其抗体效价,Western blot鉴定表达hWAPL蛋白的免疫原性。结果:①经PCR、双酶切鉴定和测序,证实hWAPL正确插入pMD18-T载体,序列正确。②经IPTG诱导的pET28a-hWAPL重组菌表达出相对分子质量(Mr)约为25000的蛋白,与预期蛋白Mr相符。③免疫小鼠后测得的平均抗体效价为1∶3200。④Western blot结果显示Mr约25000处有反应蛋白条带。结论:pET28a载体能够表达hWAPL蛋白,表达蛋白具有良好的免疫原性,其免疫小鼠后获得的多克隆抗体具有高效价和特异性。

应用PCR-RDB杂交技术检测人类乳头瘤病毒基因型的临床意义

目的采用聚合酶链反应(PCR)和反向斑点杂交(RDB)技术检测西安地区人类乳头瘤病毒(HPV)感染流行状态和HPV基因型分布特征。方法共收集266例脱落细胞标本,其中尖锐湿疣86例、宫颈上皮内瘤变144例、宫颈癌36例,应用PCR-RDB杂交技术进行23种HPV基因型分型检测。结果全部标本HPV总阳性率为71.43%(190/266),宫颈癌HPV阳性率明显高于其他疾病,差异有统计学意义(χ2=6.297,P<0.05);HPV阳性标本基因分型全部成功,HPV16型为主要感染基因型,其次为HPV18、6、11型;单基因型总感染率91.58%(174/190),多基因型总感染率8.42%(16/190)。不同疾病单基因型感染和多基因型感染构成比差异无统计意义(χ2=0.3511,P>0.05)。结论 HPV16型是西安地区主要感染基因型,应用PCR-RBD技术检测HPV基因型对HPV感染的防治具有一定临床意义。