定点突变的人胰岛素基因在CHO细胞表达的研究

目的 研究在哺乳动物细胞中表达人胰岛素。方法 采用寡核苷酸介导的定点突变方法，改造人胰岛素基因组基因，将哺乳动物细胞内蛋白质前体加工酶Ｆｕｒｉｎ 的识别和切割位点Ａｒｇ－Ｘ－Ｌｙｓ－Ａｒｇ－样序列，引入人胰岛素原Ｃ肽两端，在普通ＣＨＯ细胞表达了该改造后的基因。结果 首先应用突变引物Ⅰ：ＣＴＧＣＡＧＧＴＣＣＴＣＧＣＧＣＴＴＣＣＧＧＣＧＧＧＴＣ，引物Ⅱ：ＣＡＣＧＣＴＴＣＴＧＣＣＧＧＧＡＴＣＣＣＴＣ，按照Ｋｕｎｋｅｌ的方法，成功地进行了人胰岛素基因上两个位点的同时突变改造。利用表达载体ＰＲＣ／ＣＭＶ和突变后的胰岛素基因，构建成表达载体ＣＭＶ／ＭＩＮＳ，并在ＣＨＯ细胞中获得了表达。结论 用ＲＩＡ法检测在暂态表达的ＣＨＯ细胞培养液中人胰岛素的表达量为５．５～７０．０μＩＵ／５×１０６ 细胞·ｄ－ １。同时，还利用Ｇ４１８进行了胰岛素表达细胞株的筛选，筛选出的ＣＨＯ细胞株的表达量为：６．５～２５．５μＩＵ／５×１０６细胞·ｄ－ １。

转基因小鼠乳腺表达人胰岛素基因的研究

转基因动物乳腺生物反应器表达和生产医用蛋白是国际上的研究热点，目前已有很多成功的转基因动物乳腺表达出外源蛋白质［１］。在转基因动物乳腺表达的蛋白质包括凝血因子Ⅸ、组织纤溶酶原激活物（ｔＰＡ）、α１抗胰蛋白酶原、白介素２、蛋白质Ｃ、超氧化物歧化酶...

用富集文库克隆人胰岛素基因组基因

通过构建可富集人胰岛素基因的λ噬菌体文库，克隆了人胰岛素基因组基因．首先从中国人血液白细胞中提取到人基因组ＤＮＡ，用ＥｃｏＲⅠ和ＢｇｌⅡ对基因组ＤＮＡ进行全酶切，经０．４％琼脂糖凝胶电泳，特异回收９．５ｋｂ左右的ＤＮＡ片段．将该片段与λＥＭＢＬ３／ＢａｍＨⅠ臂连接，构建成一个特殊的人基因组λ噬菌体文库（富集文库），效价为２×１０４．同时采用ＰＣＲ方法及用引物Ⅰ：５′ＧＧＡＣＡＧＧＣＴＡＣＡＴＣＡＧＧＡＡＧＡＧＧ３′，引物Ⅱ：５′ＣＴＧＣＧＴＣＴＡＡＴＴＧＣＡＧＴＡＧＴＴＣ３′，从人基因组ＤＮＡ中扩增出一段含胰岛素基因的１．３６ｋｂＤＮＡ片段，做为放射性标记探针，对文库进行了噬菌斑原位杂交筛选，从１×１０４个噬菌斑中筛选到一个含人胰岛素基因组基因的阳性克隆，并进一步完成了亚克隆和该基因１７３２ｂｐＤＮＡ序列的测定．

医用重组人胰岛素及类似物的生产和研究

医用重组人胰岛素及类似物的生产和研究寿思明（河南医科大学病理教研室，郑州４５００５２）王文霞（河南省中医院内一病区，郑州４５０００２很多年来，医用胰岛素都是从猪和牛的胰腺提取生产的。首先成功地生产人胰岛素的方法就是对猪胰岛素的改造。猪胰岛素与天然人胰...

人促红细胞生成素基因组基因的克隆及全序列分析

为了克隆到全长的人促红细胞生成素基因，从而在真核系统中及转基因动物乳腺中进行表达，从一个中国人的血细胞中提取基因组ＤＮＡ，构建了不完全基因组噬菌体文库，文库效价为５×１０４．这种文库的构建方法是用ＢａｍＨⅠ对基因组ＤＮＡ进行完全酶切，回收１０．５ｋｂ左右的酶切片段，插入到λ－噬菌体ＥＭＢＬ３载体中．筛选文库所使用的探针是用ＰＣＲ方法从基因组ＤＮＡ模板中扩增的５５６ｂｐ的ＥＰＯ基因片段．从该文库中筛选到了一个含有完整ＥＰＯ基因的插入片段长度为１２．５ｋｂ的阳性克隆．经全序列分析证实，所克隆的ＥＰＯ基因编码正确，但在５′－侧翼及第一内含子处与国外发表的序列相比较，发现两处核苷酸差异，这两个核苷酸的差异改变了５′－调控区的两个小的开放阅读框——ＯＲＦ１和ＯＲＦ３，其在基因表达调探方面的作用值得进一步探讨．

生产重组医用蛋白质的三种途径

生产重组医用蛋白质的三种途径寿思明（河南医科大学病理教研室，郑州４５００５２）关键词重组蛋白转基因动物转基因植物重组蛋白质在医学、生物学的研究和应用中用得越来越多，随着基因工程技术的不断进步、成熟和完善，发展出多种不同的重组蛋白质生产方法。微生物、动...

人食管癌相关基因cDNA片段的克隆、筛选与初步鉴定

目的 :筛选和鉴定人原发性食管癌组织的相关基因 ,揭示食管癌的癌变机理。方法 :用高效、灵敏的荧光mRNA差异显示技术 ,以食管癌及相应的正常食管粘膜组织为对照 ,通过对其基因表达的比较 ,找出差异条带 ,利用ReverseNorthernDotBlot、DNA序列分析和NorthernBlot,并结合mRNA原位杂交技术对被筛片段进行鉴定。结果 :①在实验中分离、鉴定了 74条差异片段 ,其中包括正常组织表达而癌组织中不表达的差异片段 5 4个 ,癌组织中表达而正常组织不表达的差异片段 2 0个。②其中 1个片段C5 7(337bp)在GenBank数据库中没有发现同源的已知基因或片段 ,推测其可能为食管癌相关基因。③经NorthernBlot检测C5 7在癌组织中有表达信号。④原位杂交技术检测C5 7在癌组织中具有较高的阳性表达率 (74% )。结论 :食管癌组织中C5 7可能是新的食管癌相关的候选癌基因 。

河南省农村学龄前儿童营养状况研究

本文初步研究了我省农村学龄前儿童的体格发育、营养缺乏症、婴幼儿喂养及膳食摄入等情况。1990年我们选择滑县、杞县、禹州市、淮滨县为参加县,采用全国统一方法,对3223名学龄前儿童进行了健康检查,321名进行了家庭调查和膳食调查,同时进行了社区调查。初步分析结果表明,我省农村学龄前儿童存在一系列营养问题:(1),体格发育差、身材矮小发生率为16.3％。低体重儿发生率为10.9％;(2)营养缺乏症检出率较高,贫血发生率为40.4％,佝偻病为14.9％,蛋白质热能营养不良(PEm)为4.7％,核黄素缺乏发生率为3.8％;(3)婴幼儿喂养不合理,无论母乳喂养和混合喂养,辅食添加不及时,多在出生以后10个月后才开始添加,辅食添加率低且品种单调;(4)膳食结构不合理,膳食以植物性食物为主,热能、蛋白质、钙、视黄醇、核黄素等多种营养素摄入达不到供给量标准。针对上述情况,我们分析了原因,结合我省实际,提出了改善措施。