耐铬胶原蛋白酶产生菌的筛选及应用

通过明胶平板法结合水解铬革屑试验,筛选到一株产耐铬胶原蛋白酶的菌株。经16S r DNA基因序列相似性分析,鉴定为解淀粉芽孢杆菌,命名为B.amyloliquefaciens TCCC11319。用茚三酮显色法和原子吸收分光光度法,测定了铬革屑水解液中氨基酸浓度为45.6μmol/m L,游离铬含量为1.3mg/m L。通过高效液相色谱(HPLC)进一步分析了水解液中氨基酸成分。对菌株及其所产胶原蛋白酶的Cr(Ⅲ)耐受性分析发现,菌株B.amyloliquefaciens TCCC11319能耐受的最大Cr(Ⅲ)浓度为0.3g/m L;B.amyloliquefaciens TCCC11319产生的胶原蛋白酶能耐受的最大Cr(Ⅲ)浓度为0.8mg/m L。研究结果为生物法降解含铬胶原废弃物技术的开发提供了依据。

NADPH依赖的甘露醇脱氢酶的重组表达及甘露醇的转化条件

对NADPH依赖的甘露醇脱氢酶的异源表达和对果糖的转化情况进行分析,为在细胞内构建甘露醇的合成途径奠定基础。构建重组菌株BL21(DE3)/p ET28a-mdh,对其进行诱导发酵后,通过His标签对目的蛋白进行纯化,并利用HPLC分析纯化后的甘露醇脱氢酶转化果糖生成甘露醇的情况。成功构建了NADPH依赖的甘露醇脱氢酶重组表达菌株BL21(DE3)/p ET28amdh,并对表达后的甘露醇脱氢酶进行了纯化,测得纯化后的甘露醇脱氢酶酶活力为270 U/m L。对酶法转化果糖得到甘露醇的转化条件进行优化,确定最佳的转化条件为:当底物浓度为300 g/L,反应初始p H5.8,温度40℃,NADPH终浓度为9 mmol/L时,甘露醇转化率可以达到97.4%。实现了NADPH依赖的甘露醇脱氢酶在大肠杆菌中的活性表达,为进一步研究大肠杆菌合成甘露醇的代谢调控提供了依据。

黑曲霉内切菊粉酶基因在毕赤酵母中的表达及应用研究

利用PCR方法从黑曲霉(Aspergillus niger)基因组DNA中扩增内切菊粉酶(endo I)全长基因(1551 bp),经序列分析后将其连接到表达载体p PIC9K上,得到重组表达载体p PIC9K-endo I。重组质粒经Sac I线性化并电转化到毕赤酵母GS115,阳性转化子进行发酵产酶后考察其酶学性质。酶学性质研究表明,重组酶的最适p H和最适温度分别为5和60℃,重组酶在55℃下保温9 h后,重组菊粉内切酶仍残余83.2%的活性,表现出极高的热稳定性,Cu^(2+)、Ag^+对重组酶有明显的抑制作用。对内切菊粉酶水解菊粉的过程研究表明,重组内切菊粉酶能在8 h内将4%(w/v)菊粉水解为3~6个聚合度的低聚果糖,水解11 h后,低聚果糖得率达到63.5%,本研究为进一步开发以菊粉为原料生产低聚果糖的应用奠定了基础。