用人外周血线粒体DNA 4977bp缺失检测辐射损伤初探

初步探索用聚合酶链反应(PCR)方法进行辐射诱导的线粒体DNA4977bp缺失分析的可行性。对正常人外周血进行2GyCoγ射线的照射,照射后提取包含线粒体DNA的全基因组DNA,用PCR方法进行线粒60体DNA4977bp缺失分析,同时扩增很少缺失的线粒体DNA片段(16S?ND1);进而比较照射前后线粒体DNA4977bp缺失水平。结果表明,用于分析线粒体DNA4977bp缺失的引物对在最佳试验条件下,可特异性扩增出所有2Gy照射诱导的线粒体DNA4977bp缺失;该扩增产物经纯化、测序和核苷酸同源性分析,证实线粒体缺失发生在线粒体DNA序列的8470?13446bp。用于扩增16S?ND1的引物对在很大的温度变动范围内,均能扩出目的DNA片段。所有外周血样品在照射前无线粒体DNA4977bp缺失,2Gy60Coγ射线照射后特异诱导出此缺失。说明用本研究中建立的PCR方法,可用来分析电离辐射诱导的外周血有核细胞线粒体DNA4977bp缺失水平。

人外周血线粒体DNA4934bp自发缺失及^(60)Coγ射线诱发缺失的剂量效应关系初探

为探索正常人群外周血样品中线粒体DNA(mtDNA)4934bp缺失的发生比例及电离辐射是否可以诱发该缺失,对109例正常人外周血样品进行分析,确定正常人外周血样品中发生该缺失的比例,将3例缺失阳性正常人外周血样品,使其受到0、2和6Gy60Coγ射线照射,对4934bp缺失发生情况进行研究;经分析发现,41%的正常人外周血样品具有该缺失,聚合酶链反应PCR产物经克隆、测序和核苷酸同源性分析证实该缺失发生在线粒体DNA重链nt8435-nt13368之间。自发缺失发生比例与供者年龄增长相关(p<0.01),与性别无关。使用半定量聚合酶链反应(Polymerase chain reaction,PCR),缺失阳性正常人外周血样品在接受0、2和6Gyγ射线照射后,检测其mtDNA4934bp的缺失情况,发现在照射前后外周血线粒体DNA均有该缺失;以正常人外周血所做的半定量分析发现在照射0、2和6Gy后该缺失水平分别为23、25和27。说明电离辐射诱发人外周血样品缺失水平随剂量增加而增高。

电离辐射诱导淋巴细胞线粒体DNA 889bp和3895bp缺失的分析

探索电离辐射是否诱导人淋巴细胞永生化细胞系mtDNA 889bp和3895bp缺失。对指数生长期的人淋巴细胞永生化细胞系照射10Gy ^(60)Coγ射线,照射后24h、48h提取纯线粒体DNA,用巢式巢式聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)方法进行线粒体DNA 889bp、3895bp缺失分析,与未照射细胞系进行比较;并将纯化的第二轮PCR产物进行测序和核苷酸同源性分析。结果表明,用于分析线粒体DNA 3895bp缺失的引物,可特异性扩增出10Gy照射诱导的淋巴细胞线粒体DNA 3895bp缺失,该扩增产物经纯化、测序证实线粒体缺失发生在线粒体DNA序列的548-4443bp之间。研究发现,用于扩增线粒体DNA 889bp的引物在扩增出目的DNA片段的同时,也可扩增出未发生缺失的DNA片段。第二轮缺失片段扩增产物经纯化、测序证实线粒体缺失发生在线粒体DNA序列的11688-12576bp之间。所有未照射细胞无线粒体DNA 889bp和3895bp的缺失。说明电离辐射可诱导淋巴细胞线粒体DNA 889bp和3895bp的缺失。

男性性腺发育不全患者外周血淋巴细胞永生细胞系的建立

目的 建立男性性腺发育不全患者外周血永生细胞系以保存性腺发育不全患者特有的基因组资源 ,为进一步探讨性腺发育不全的发生机理提供材料。方法 收集 4 0例男性性腺发育不全患者的外周血样品 ,采用EB病毒转化技术 ,把患者外周血B淋巴细胞转化成永生淋巴母细胞系 ;用遗传学方法检测其建系前后的遗传稳定性。结果 建系成功 4 0例 ,所有建成的细胞系冻存后复苏成功率 10 0 % ,核型和DNA分析表明建系前后遗传是稳定的。结论 性腺发育不全患者永生细胞系的建立 ,为进一步研究性腺发育不全导致的不育症分子水平发病机理提供随时可取的实验材料。

^(60)Coγ射线照射淋巴细胞诱导PIG3和GADD45基因mRNA变化

用^(60)Coγ射线照射正常人外周血永生化淋巴细胞系后,初步分析受照细胞中PIG3和GADD45基因mRNA表达水平的改变状况,并探讨上述基因作为辐射生物剂量计的可能性及意义。用^(60)Coγ射线照射淋巴细胞,采用不同剂量(0～10Gy)照射和照射后不同时间点(0～72h)收集细胞,抽提mRNA,用Real-time PCR检测细胞中PIG3和GADD45基因mRNA表达水平的变化。结果表明,正常人外周血永生化淋巴细胞系中PIG3和GADD45基因mRNA表达水平随照射剂量的增高而增加,并呈现出剂量效应关系。5Gy剂量^(60)Coγ射线照射后,淋巴细胞中PIG3和GADD45基因mRNA表达水平随时间的推移不断增高,在8h时均达到最高,随后开始降低。PIG3和GADD45基因对辐射均较敏感,其表达具有良好的剂量效应和时间效应关系,但相比而言,PIG3的表达随照射剂量和照射后时间的变化更加显著,更有潜力作为生物剂量计以满足实际需要。

用基因芯片技术分析不同剂量^(60)Coγ射线照射后淋巴细胞株的差异基因表达谱

用基因芯片来筛选不同剂量辐射诱导的差异表达基因,为快速生物剂量指标的筛选提供科学依据。用0.5、3和8Gy 60Coγ射线照射指数增长期的淋巴细胞永生化细胞株,24h后提取细胞总RNA、反转录成cDNA、标记后用基因芯片筛选各剂量点的差异表达基因;并用实时荧光PCR对某些基因表达水平进行定量分析。结果发现,0.5、3和8Gy剂量组分别有16、240和462个差异表达基因,其中在三个剂量组均上调或下调的基因分别为4个和3个。对TP53I3基因进行实时荧光PCR定量分析,结果与芯片结果一致。电离辐射诱导的TP53I3、GDF15、CDC43EP5、S100A4、IGJ和KLF2等基因的mRNA表达水平变化有可能与照射剂量有关。

人参皂苷Rh_2对SP2/O骨髓瘤细胞的作用及其机制的初步探讨

目的:观察人参皂苷单体成份Rh2(G-Rh2)对于骨髓瘤细胞SP2/O的作用并对其可能的机制进行了初步探讨。方法:应用10μg/mL至120μg/mL6个不同浓度的人参皂苷单体成份Rh2干预SP2/O细胞72 h后,利用MTT法检测细胞增殖抑制作用;并分别在24 h和48 h,利用流式细胞术检测SP2/O细胞凋亡率及细胞周期;常规Giemsa染色和DAPI荧光染色后观察SP2/O凋亡细胞的形态学变化;利用酶联免疫吸附(ELISA)法,测定药物干预前后细胞上清液中肿瘤坏死因子α(TNFα)、巨噬细胞炎症蛋白-1α(MIP-1α)的水平。结果:G-Rh2在10μg/mL至120μg/mL的浓度范围内均能抑制SP2/O细胞生长增殖,呈剂量依赖性;G-Rh2可诱导SP2/O细胞凋亡,呈现出时间剂量依赖性。24 h后,60μg/mL的浓度诱导凋亡的作用较明显;48 h后,80μg/mL的浓度诱导凋亡的作用较明显;G-Rh2作用后,G0/G1、G2/M期细胞数目减少,S期细胞明显增加;G-Rh2干预不影响TNFα、MIP-1α的产生。结论:G-Rh2对SP2/O骨髓瘤细胞有明显的增殖抑制和诱导凋亡作用,且这种作用有周期特异性。

Calyculin A诱导早熟染色体凝聚的电离辐射剂量效应曲线

以Calyculin A诱导早熟染色体凝聚(PCC)方法,探索G2/M-PCC细胞中PCC环用于分析电离辐射损伤程度的可行性,用0—20 Gy(剂量率为1 Gy/min)的60Coγ射线照射外周血,培养48 h并用Calyculin A诱导PCC。分析各剂量点G2/M-PCC指数、判断观察到的PCC环是否符合泊松分布,建立PCC环率与剂量之间的剂量效应曲线。结果发现,用Calyculin A可成功诱导人外周血淋巴细胞产生PCC,且G2/M-PCC指数随着剂量水平的增高而降低。除20 Gy剂量外,0—16 Gy各剂量点样品中PCC环的分布符合泊松分布。PCC环率随着剂量增加而增加,剂量-效应曲线可以拟合成y=0.0128x+0.0104直线方程,测得R2=0.9898(y为PCC-R率,x为剂量);二次多项式方程为y=0.00002x2+0.0085x+0.0011 R2=0.9996。由此可见,Calyculin A诱导淋巴细胞G2/M-PCC中的PCC环率可用于生物体电离辐射损伤程度测定。

中国儿童孤独症家系外周血淋巴细胞永生细胞系的建立

目的试图建立外周血淋巴细胞、永生化细胞系以保存孤独症患者家系特有的基因组资源,为进一步探讨孤独症的发生机理提供材料。方法在知情同意的情况下收集66个原发性孤独症核心家系成员的外周血样品,采用EB病毒转化技术,将外周血B淋巴细胞转化成永生化淋巴母细胞系;并用遗传学方法检测其建系前后的遗传稳定性。结果建系成功孤独症病例60例,父母成功132例,所有建成的细胞系冻存后复苏成功率100%,染色体核型分析表明建系前后遗传是稳定的。结论本研究建立的孤独症患者永生细胞系,可为进一步研究孤独症的分子水平发病机理提供随时可取的实验材料。

性别和年龄对60Co γ射线照射离体人外周血辐射敏感基因mRNA表达的影响

目的:探讨性别和年龄因素对电离辐射诱导的离体人外周血中辐射敏感基因mRNA表达变化的影响。方法:采集30例健康人离体外周血,以剂量率为1 Gy/min的60Coγ射线进行照射,照射剂量分别为0.5、1、2、3、4、6和8 Gy(以0 Gy为阴性对照组),照射后培养12 h,应用实时荧光定量PCR(qPCR)方法检测18个辐射敏感基因的mRNA表达水平变化,分析性别和年龄因素对这些基因mRNA表达水平的影响。结果:与阴性对照组相比,各剂量γ射线照射组人外周血18个辐射敏感基因的mRNA表达水平均明显增加,并且呈剂量-效应关系(R2=0.63~0.97,P<0.05)。在相同照射剂量,MDM2、XPC、FDXR、DDB2、ASTN2和TNFSF4 mRNA相对表达水平在不同个体之间存在较大的差异。女性外周血中BAX、TNFRSF10B、ASTN2、TNFSF4、POLH和GADD45A mRNA相对表达水平均高于男性,在0.5~8 Gy照射剂量范围内具有统计学差异(P<0.05或P<0.01)。MDM2、FDXR、DDB2和RPS27L mRNA表达水平在不同年龄组间(20~29岁、30~39岁、40~49岁和50~60岁)存在差异(P<0.05或P<0.01)。结论:离体人外周血中辐射敏感基因mRNA表达水平的变化存在个体间差异,且与受照者性别和年龄相关。

^(60)Coγ射线诱导人淋巴细胞线粒体Cytb、ATPase6和ATPase8基因表达改变的研究

用实时荧光定量PCR(Real-timePCR)探讨了60Coγ射线诱导人淋巴细胞线粒体Cytb、ATPase6和ATPase8基因表达的改变。以1、3、5、8和10Gy60Coγ射线分别照射指数增长期的人淋巴细胞永生化细胞株,8h后利用逆转录PCR(RT-PCR)摸索各基因的最佳实验条件,进而利用Real-timePCR的方法定量检测各基因表达变化,观察辐射对Cytb、ATPase6和ATPase8基因表达影响的量效关系;同时以5Gy60Coγ射线照射人淋巴细胞后,分别于不同时点(0.5、4、8、12、24、48和72h),通过RT-PCR和Real-timePCR方法检测各基因表达的变化,观察其时效关系。结果发现,在mRNA水平上,线粒体Cytb、ATPase6和ATPase8基因表达总体上调。Cytb和ATPase8基因在8Gy剂量范围内,呈现出随剂量增加基因表达增强的量效关系趋势;观察时效关系,发现5Gy剂量照射后4h左右,3种基因表达增强最显著,且Cytb和ATPase8基因分别持续高表达至48h和72h。因此,60Coγ射线可以诱导人淋巴细胞线粒体Cytb、ATPase6和ATPase8基因表达的改变,总体上呈现表达增强趋势。

^(60)Coγ射线照射人血淋巴细胞诱导p53相关基因mRNA表达水平的变化

采用不同剂量(0~10 Gy)60Coγ射线照射人外周血淋巴细胞,通过抽提mRNA,采用real-timePCR检测不同剂量照射后淋巴细胞中GADD45和CDKN1A基因mRNA表达水平的变化。筛选出最佳照射剂量(5 Gy)后,用该最佳照射剂量照射淋巴细胞,检测不同时间点(0~72 h)淋巴细胞中GADD45和CDKN1A基因mRNA表达水平的变化。结果表明,淋巴细胞中GADD45和CDKN1A基因mRNA的表达水平随照射剂量的增加而增加,并呈现出剂量效应关系。在5 Gy最佳剂量照射后,淋巴细胞GADD45基因mRNA表达水平随时间的推移不断增高,在8 h时达到最高,随后开始逐渐降低;淋巴细胞CDKN1A基因mRNA表达水平随时间的推移未见明显变化趋势。淋巴细胞系中GADD45和CDKN1A基因mRNA的表达水平与照射剂量均有较好的剂量效应关系,两者均有可能作为电离辐射的生物剂量计来估算受照剂量水平。

甲基化芯片检测电离辐射诱导人外周血淋巴细胞DNA甲基化水平的变化

目的:筛选正常人细胞基因组中电离辐射后甲基化水平发生变化的基因,为在其中寻找新型辐射损伤标志物奠定研究基础。方法:60Coγ射线照射人外周血全血,照射剂量为0、0.5和2.0 Gy。利用Illumina 450K芯片检测外周血淋巴细胞基因组DNA甲基化水平的变化,筛选甲基化水平差异的基因,利用GO功能富集分析基因的分子功能和参与的生物学途径。结果:0.5和2.0 Gyγ射线照射下人外周血淋巴细胞基因组DNA甲基化水平显著上调的基因有1311个,显著下调的基因286个。GO功能富集分析表明,按富集度大小排列,差异基因在生物途径水平上排在首位的是“细胞过程”(富集度=5.86),在细胞定位水平上排在首位的是“细胞”(富集度=7.48),在分子功能水平上排在首位的是“结合”(富集度=5.27)。进一步细分后得到差异基因显著富集在与转录调控及转录因子活性相关的功能上,与以往的研究结果认为DNA甲基化参与转录调控和基因表达相一致;甲基化水平差异基因还显著富集在核苷连接(GO:0001882)上,并在其中寻找到与DNA修复相关的基因RAD50、RAD54L和INIP,以及与维持染色体结构稳定相关的基因HIST1H4K、SMC1B。结论:正常人外周血淋巴细胞基因甲基化水平受电离辐射影响,可进一步研究将这些与DNA修复、维持染色体结构稳定相关的基因甲基化水平作为辐射损伤标志物的可行性。

早熟染色体凝聚最长染色体长宽比和最长与最短染色体长度比作为估算辐射剂量指标的研究

目的:用花萼海绵体诱癌素A(calyculin A,CA)诱导早熟染色体凝聚(prematurc chromosome condensation,PCC),探索将G_2/M-PCC细胞中最长染色体长宽比(L/B)和最长与最短染色体长度比(L/L)用于分析电离辐射损伤和作为估算辐射剂量指标的可行性。方法:分别用0、4、8、12、16和20Gy(剂量率为1Gy/min)的^(60)Coγ射线照射外周血,培养48h后用50nmol/L CA诱导PCC。分析各射线照射剂量组G_2/M-PCC指数,并进一步分析G_2-PCC、M-PCC中L/B和L/L值的变化,建立L/B和L/L值与射线照射剂量之间的剂量-效应曲线。结果:用CA可成功诱导人外周血淋巴细胞产生PCC,G_2/M-PCC指数随着照射剂量水平的增高而降低(P<0.05)。G_2-PCC、M-PCC分裂相中的L/B和L/L值在8～20 Gy范围内显著增大(P<0.05或P<0.01),在同样照射剂量水平上L/L值较L/B值增加更快(P<0.05或P<0.01)。结论:CA诱导淋巴细胞G_2/M-PCC中的L/B和L/L值可用于电离辐射损伤程度的测定和作为估算辐射剂量的指标。

红花提取物不同组分的体外抑瘤实验研究

目的：探究红花提取物抑瘤作用的有效组分。方法：选择人慢性粒细胞白血病K562细胞、人肝癌SMMC7721细胞、人宫颈癌HeLa细胞、人肺癌细胞H1299及A549共5株人常见肿瘤细胞株，用细胞计数试剂盒（cell counting kit-8，CCK-8）方法对红花提取物及大孔树脂水一乙醇洗脱后的不同有效组分共6个供试品进行体外抑瘤作用评价，绘制浓度效应曲线，计算半数抑制浓度（IC50），比较各有效组分的抑瘤效果。结果：红花提取物各有效组分对肺癌细胞的抑制效果较好，IC50为16．24～189．86μg／mL，其次为K562、SMMC7721及HeLa细胞。红花提取物脂溶性组分抑瘤作用较水溶性组分好，如红花提取物95％醇溶组分x~5株肿瘤细胞均有明显的抑制作用，Ic。为16．24～66．51μg／mL。结论：红花提取物在体外对多种癌细胞有抑制作用，尤其是对肺癌细胞，其抑瘤作用有效物质可能是脂溶性组分。

^(60)Co γ射线诱导线粒体复合体Ⅰ亚基因表达改变的研究

为探讨电离辐射对人淋巴细胞线粒体复合物Ⅰ亚基因表达的影响,采用1、3、5、8和10Gy^(60)Co γ射线分别照射指数生长期的人淋巴细胞永生化细胞株,8h后利用逆转录PCR(RT-PCR)摸索各基因的最佳实验条件,进而利用实时荧光定量PCR(Real-timePCR)方法定量检测各基因表达变化,观察辐射对复合物Ⅰ基因表达影响的剂量效应关系;同时以5Gy^(60)Co γ射线照射人淋巴细胞后,分别于不同时间点(0.5、4、8、12、24、48和72h),同样通过RT-PCR和Real-timePCR方法检测各基因表达的变化,观察其时效关系。结果表明,在mRNA水平上,线粒体复合物Ⅰ基因表达总体上调。剂量效应关系方面,ND2基因在8Gy剂量范围内呈现出随剂量增加基因表达增强的趋势;时效关系方面,7种亚基均在5Gy剂量照射后4h左右表达增强最显著,且大部分基因可持续高表达至48或72h左右。说明电离辐射可以诱导人淋巴细胞线粒体复合物Ⅰ基因表达的改变,表达总体上调。

一种快速分离纯化外周血细胞线粒体DNA方法的建立

目的探索快速分离纯化人外周血细胞线粒体DNA(mtDNA)的方法。方法收集抗凝外周血,首先破红细胞,然后裂解白细胞,去除细胞膜和核DNA后获得mtDNA;再经过去除蛋白和RNA,获得纯mtDNA。用PCR扩增人线粒体ND1基因片段,PCR产物经纯化后测序和核苷酸同源性分析。结果用本研究中建立的方法制备的mtDNA纯度高,每毫升抗凝血可获得100ng左右的mtDNA。经过PCR扩增ND1基因433bp片段,较用细胞总DNA为模板,模板用量少,扩增产物多。测序后经核苷酸同源性分析证实扩增片段为ND1基因。结论本研究中建立的快速分离外周血细胞mtDNA的方法,可制备高纯度的mtDNA用于线粒体相关研究。

红花水提物不同有效部位的体外抗辐射作用及机制研究

目的:通过对红花水提物中不同有效部位进行抗辐射效应及作用机制的初步探讨,为开发新型安全有效的辐射防护药物提供实验依据。方法:红花药材用蒸馏水60℃提取得红花水提物,采用大孔树脂HP-20洗脱分离得到水部位和30%、50%、70%、95%醇部位,采用电子自旋共振波谱仪(ESR)检测红花水提物不同有效部位清除自由基的能力;经红花水提物30%及5%醇部位处理后,利用CCK-8法检测其对^(60)Co γ射线照射后人肝L02细胞存活率的影响;流式细胞术研究其对^(60)Co γ射线照射后人淋巴细胞AHH-1细胞凋亡、细胞周期及Bcl-2/Bax比率的影响。结果:ESR自由基清除实验显示红花水提物的不同有效部位均具有清除自由基能力,半数抑制浓度IC 50值为1.7~79.7 mg/m L。CCK-8法检测结果显示30%及50%醇部位处理辐照后L02细胞的存活率分别为128.3%及130.9%,与照射组比较显著增加(P<0.01)。流式细胞术结果显示与照射组凋亡率(24.7%±4.4%)比较,红花水提物30%及50%醇部位处理组凋亡率分别为15.3%±1.6%及15.2%±1.9%,明显降低(P<0.01)。细胞周期实验结果显示与照射组AHH-1细胞G2/M期比例(45.7%±0.7%)比较,红花水提物30%及50%醇部位处理组G2/M期细胞比例分别为(42.3%±0.6%)及(36.4%±0.4%),差异有统计学意义(P<0.01),同时红花水提物30%及50%醇部位能缓解照射引起的Bcl-2/Bax比率下降(P<0.05)。结论:红花水提物的30%及50%醇洗脱部位对^(60)Co γ射线照射的L02、AHH-1细胞具有明显的辐射防护作用,其作用机制可能与清除自由基、改善细胞周期G2/M期阻滞、调控Bcl-2/Bax比率进而抑制细胞凋亡有关,可作为潜在的安全有效的抗辐射药物继续研究。

线粒体基因组及其在辐射生物学中的研究进展

线粒体DNA是人类细胞中唯一核外遗传物质,缺乏组蛋白的保护和DNA修复系统,对辐射等氧化损伤更敏感。综述了近年来线粒体DNA与辐射敏感性、辐射剂量效应关系、辐射致突变以及肿瘤等领域的探索性研究,并就线粒体DNA研究技术在辐射生物学领域的应用前景进行阐述。

不同种类细胞株对UVB紫外线的耐受性初探

目的:探索几种细胞株对UVB紫外线的耐受性。方法:0、20和50 mJ/cm紫外线照射后,利用MTT、荧光素酶报告基因检测和克隆形成率实验,检测人表皮细胞HaCaT、人黑色素细胞A875、人肺腺癌细胞A549和H322、人肝癌细胞HepG2的存活及2增殖能力。结果:MTT实验结果表明HaCaT、A875、A549、H322和HepG2细胞在受到20和50 mJ/cm紫外线照射后第1天,细胞活力均显著降低(P<0.05),到照射后第3天,细胞活力仍显著低于未照射组(<0.05)。克隆形成率实验结果表明,HaCaT、A875和2HepG2细胞在照射后,细胞增殖能力受到显著抑制。荧光素酶活性检测实验结果表明,A549细胞在受到20和50 mJ/cm紫外线照射后第5和第10天,细胞活力显著低于未照射组(P<0.05)。结论:UVB紫外线对表皮细胞、肺腺癌细胞和肝癌细胞的存活和增殖能力均产生影响,其中正常表皮细胞HaCaT细胞对UVB紫外线的耐受性大于肿瘤来源的A875、A549、H322和HepG2细胞。