湖羊瘤胃微生物葡聚糖酶基因GH5-47的原核表达与酶学性质研究

葡聚糖是谷物类饲料中主要的一种抗营养因子,β-葡聚糖酶能打断β-葡聚糖主链糖环间的糖苷键并释放出低聚寡糖或单糖,作为饲用酶制剂在畜牧生产中具有重要应用价值。本课题组前期采用宏转录学技术筛选获得多个葡聚糖酶基因候选序列,本研究利用PCR技术扩增瘤胃微生物cDNA获得新型葡聚糖酶基因GH5-47,采用同源重组技术构建相应的大肠杆菌工程菌。结果表明:GH5-47蛋白的理论分子量和等电点分别为40.6 ku和4.62;重组GH5-47在pH4.0~6.0或50℃以下较为稳定,其最适反应pH为5.0,最适反应温度为50℃,对0.5~10 mmol/L K^(+)或EDTA表现较强耐受能力;重组GH5-47能催化大麦葡聚糖、苔藓地衣多糖和魔芋胶底物,最大反应速率(Vmax)分别为1 111、895.8、15.15μmol/(min·mg protein)。此外,该蛋白对魔芋胶具有一定降解能力。本研究克隆、表达了一种来自瘤胃未培养微生物的新型葡聚糖酶GH5-47,该酶属弱酸性、嗜温的多底物活性酶。

一种来源于喜热梭孢壳的耐热型β-甘露聚糖酶

【目的】本文旨在挖掘满足工业加工所需的新型耐热β-甘露聚糖酶。【方法】从丝状真菌喜热梭孢壳中克隆甘露聚糖酶基因Mtman1,利用毕赤酵母表达系统进行异源表达,研究重组酶的酶学性质和热处理过程中蛋白构象变化情况。【结果】序列分析显示,Mtman1基因编码409个氨基酸,包含一段20个氨基酸的信号肽序列和一个GH5家族结构域;经毕赤酵母表达的重组MtMAN1蛋白约为60 kDa,存在N-糖基化修饰,该酶的最适反应pH和温度分别为6.0和70℃,催化刺槐豆胶底物的K_(m)和V_(max)分别为4.28±0.73 mg/mL和203.9±14.61μmol/(s·mg);MtMAN1在60℃下十分稳定,在80℃、90℃和100℃下处理10 min后,分别能维持(68.23±7.47)%、(56.01±5.69)%和(14.91±2.92)%的残余活性,且二级结构和最大发射波长基本没有发生变化,提示其构象维持稳定;此外,该酶对较低浓度的Fe^(2+)(<0.1 mmol/L)、Cu^(2+)(<0.1 mmol/L)、Ca^(2+)(<0.5 mmol/L)、Mg^(2+)(<0.1 mmol/L)或Zn^(2+)(<0.1 mmol/L)耐受能力较强。【结论】MtMAN1是一种耐热的β-甘露聚糖酶,在饲料制粒等需要高温处理的工业加工工艺中具有较好的应用前景。