新型阳离子基因传递载体PEI-PBLG的细胞转染研究

对新型阳离子聚合物PEI（10kD）-PBLG进行研究，重点考察其基因转染效率与细胞毒性，探讨其作为基因载体的可能性。通过粒径分析及扫描电镜（SEM）观察PEI（10kD）-PBLG与质粒pEGFP自组装形成的颗粒形态及粒径，预测其进入细胞的可能性。使用MTT比色法分析PEI（10kD）-PBLG、PEI（25kD）．PBLG、PEI（10kD）和PEI（25kD）的细胞毒性差异。选用表达增强型绿色荧光蛋白的质粒pEGFP作为报告基因模型，将其与PEI（10kD）-PBLG自组装后，分别转染真核细胞株Hela、COS-7、Vero-E6和ECV304，应用流式细胞术检测细胞转染效率，并比较了血清、缓冲液、细胞谱等多种因素对基因转染效率的影响。PEI（10kD）-PBLG可包裹质粒形成粒径100—120nm的纳米复合物，适合介导质粒进入细胞。该纳米粒复合物对转染缓冲液的敏感度较低，并能够在10％血清存在的条件下，转染全部实验用细胞株，尤其对Hela的转染效率最高，其次是COS-7、Vero-E6和ECV304；其中PEI-PBLG（10kD）／pEGFP复合物转染Hela细胞的比率为45．02％，高于Pri（10kD）／pEGFP的29．16％；PEI（10kD）-PBLG的细胞毒性作用显著低于PEI（25kD）、PEI（10kD）和PEI（25kD）-PBLG。新型阳离子多聚物PEI（10kD）-PBLG在提高PEI介导的基因转染效率的同时降低了其细胞毒性，提高了生物相容性，有望成为基因转移的有效载体。

傅里叶变换表面等离子体共振频率对金膜表面溶液折射率响应

采用新型傅里叶变换表面等离子体共振仪(FT-SPR),测定了NaCl、KCl和乙醇3种水溶液在不同浓度下的SPR响应值,建立了SPR响应与溶液浓度和折射率之间的定量关系R=1.53×105(n-1.3333),测定了FT-SPR 100型仪器的折射率响应常数m=1.53×105,即液体折射率每变化0.000 1,FT-SPR响应值变化为15 cm-1。其结果为用FT-SPR直接测定液体样品的折射率提供了可能。

单克隆抗体夹心ELISA检测SARS病毒抗原的研究

目的:建立单克隆抗体(McAb)夹心ELISA法,用于检测SARS病毒(SARS-CoV)抗原。方法:用间接夹心ELISA法筛选捕捉和标记用单克隆抗体的组合,采用过碘酸钠法标记辣根过氧化物酶(HRP),优化后用于检测SARS-CoV。结果:从12株抗SARS-CoV鼠单克隆抗体中筛选出2A3/1C5组合用于捕捉SARS-CoV,1A5/1B4组合标记HRP作为指示抗体。优化后2A3/1C5的最适工作浓度为1∶4000,HRP-1A5/1B4的最适工作浓度为1∶2000。本方法检测SARS-CoV的敏感度为105pfu/mL。结论:单克隆抗体夹心ELISA法可特异性检测SARS-CoV抗原。

生物发光技术在活体成像检测中的应用

生物发光体内成像检测技术已广泛应用于许多动物实验中,其优势在于可对特定的细胞和分子行为进行非侵入性的体内评价和连续动态研究,这些细胞和分子往往是药物作用或基因治疗的靶点。该技术有效减少了所需实验动物的数量,也减小了因个体差异引起的误差,改进了数据点的质量。

东部马脑炎病毒E2基因与GM-CSF共表达质粒的构建及其免疫原性初步研究

目的:利用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)作为基因佐剂,提高东部马脑炎病毒E2基因重组质粒的免疫效果。方法:分别扩增E2基因与GM-CSF基因,连接进入含有内部核糖体插入位点(IRES)的真核表达载体中,构建共表达质粒。Lipofectamine2000介导转染真核细胞BHK-21,反转录PCR检测E2和GM-CSF两个基因的转录,Western印迹法和间接免疫荧光法(IFA)检测细胞内E2基因表达产物的抗原性。通过肌肉注射免疫BALB/c小鼠,IFA法测定血清抗体效价,FACS测定免疫小鼠脾细胞中CD4+/CD8+淋巴细胞构成比,初步观察共表达质粒的免疫原性。结果:经酶切鉴定与序列测定证明重组共表达质粒中含有E2和GM-CSF两个基因且序列正确。转染细胞的反转录PCR可见E2和GM-CSF两个基因的转录。Western印迹结果可见转染细胞的裂解液在相对分子质量50000位置有特异性条带。将转染细胞制成荧光抗原片,经IFA检测可见胞浆中出现特异荧光。免疫小鼠的最高血清抗体效价为1∶160,但细胞免疫未观察到明显的提高。结论:构建的共表达质粒pE2-IRES-mGM-CSF具有良好的免疫原性,能有效刺激小鼠特异性体液免疫应答,提高了E2基因重组质粒诱导的血清抗体效价。

应用光亲和分子进行PEG的光照修饰及蛋白质的光照偶联

合成了一种光活性标记分子-对叠氮苯甲酸,将其偶联到具有双羟基的碳酸酯与乳酸的共聚物P(LA-co-DHP)上,获得了具有光反应活性的可生物降解共聚物P(LA-co-DAP),在光照条件下,可以将蛋白质方便快捷地共价偶联到P(LA-co-DHP)聚合物纤维上.在溶液中进行PEG与对叠氮苯甲酸的光照反应,通过核磁共振光谱检测,证明了对叠氮苯甲酸可以直接修饰到PEG侧链上,形成苯甲酸侧基PhCOOH.这是其它化学修饰方法很难做到的.实验还证明,对叠氮苯甲酸对PEG的光亲和修饰不但能在溶液中进行,而且能在PEG自组装膜的表面进行.