甲烷生物催化氧化制甲醇──固定化细胞催化剂的制备及其催化性能的研究

研究了利用无机载体（活性炭、氧化铝、分子筛等）吸附法和天然藻胶（海藻酸钙等）包埋法制备的固定化甲烷氧化细菌的催化性能及其在生物反应器中的反应．结果表明，在进行甲烷制甲醇的反应中，活性炭吸附制备的固定化细胞的操作稳定性最好，但其初始酶活性与休止游离细胞相比损失了６０％～８０％；海藻酸钙包埋的固定化细胞初始酶活性高（与游离细胞相比，可保持５５％～９０％的酶活性），但反应中甲醇累积速率很低；而双重介质（琼脂陶瓷粒）包埋的固定化细胞有利于保持固定化细胞的酶活性，增加操作稳定性。

甲烷氧化细菌Methylosinus trichosporium 3011甲醇累积条件的研究

本文考察了甲烷氧化细菌Methylosi nus trichosporium 3011的生理特性及反应条件对甲烷单加氧酶和甲醇累积的影响。M.3011菌株在4℃保存30～40天内,菌株的细胞生长量和甲烷单加氧酶活性均不受影响。在生长对数期收获细胞,其甲烷单加氧酶活力最高可达125nmol甲醇/mg(细胞干重)·min。在M.3011菌株的生长对数期后期收集细胞,将反应菌悬液浓度控制在0.15—0.3mg(细胞干重/ml,pH为6.7,反应温度为35℃,甲醇累积量可达3.1μmol甲醇/mg(细胞干重)·h。反应液的磷酸缓冲液的最适浓度为60mmol/L。

甲烷生物催化氧化制甲醇——几种化学物质对Methylosinus trichosporium 3011甲醇累积的影响

本文报导了在 Methylosinus trichosporium 3011细胞反应液中加入一些化学物质对甲醇累积的影响。结果表明,Na^+抑制甲烷单加氧酶的活性。当 M.trichosporium 3011细胞反应液中含高浓度磷酸根时,只有很少量甲醇累积下来。EDTA 和 Na_2EDTA 甲醇累积的促进作用小于甲酸钠或甲酸的作用。但由于 EDTA 不仅可以抑制甲醇脱氢酶的活性,而且可以螯合 Na^+,而甲酸则可使 NADH 辅酶再生。因此,反应液中含有2mM EDTA 和20mM 甲酸时甲醇累积量最高。

丙烯经酶催化氧化制环氧丙烷——一株甲烷氧化细菌的分离筛选及生理特性的研究

环氧丙烷是聚氨酯、不饱和聚酯和优质洗涤剂的主要原料,还可用于油漆、化妆品等,是一种非常重要的精细化工原料。目前环氧丙烷主要用氯醇法和烷基过氧化氢法生产。1963年,Vender Lindent发现庚烷菌P.Seruginosa的休止细胞可使辛烯-1氧化成环氧辛烷,首次提出了烯烃经生物催化环氧化生成相应环氧化物的过程。1977年,Colby等报导了从Methylococcus capsu-latus(Bath)菌中提取了非专一性菌甲烷单加氧酶。1979年,C.T.

甲烷单加氧酶的催化机理

研究了来源于Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓｓｐ．ＧＹＪ３菌的甲烷单加氧酶（ＭＭＯ）的催化机理．结果表明，用还原剂处理羟基化酶可得到不同还原态的羟基化酶，其中全还原态的羟基化酶具有ＭＭＯ催化活性，还原酶和调节蛋白单独存在时均没有ＭＭＯ活性，确定了羟基化酶组分是ＭＭＯ的催化活性中心．用紫外光谱法证实了ＮＡＤＨ和还原酶之间的相互作用，即还原酶接受ＮＡＤＨ的电子，使氧化态的ＦＡＤ转化为还原态的ＦＡＤ．ＭＭＯ的电子传递过程为ＮＡＤＨ→还原酶→羟基化酶．调节蛋白作用于还原酶和羟基化酶的电子传递过程能使ＭＭＯ的活性提高４０倍．

甲烷单加氧酶的催化性能

研究了来源于Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓｓｐ．ＧＹＪ３菌的甲烷单加氧酶（ＭＭＯ）的催化性能．结果表明，当组成该酶的三个组分，羟基化酶、调节蛋白Ｂ和还原酶的摩尔比为１∶１．７∶２．０时，重组的ＭＭＯ体系酶的比活最高，为３４２ｎｍｏｌ／（ｍｇ·ｍｉｎ）．当反应体系的ｐＨ在６．５～７．５时，ＭＭＯ酶的活力最大．研究了纯ＭＭＯ催化甲烷羟基化反应和丙烯环氧化反应的特性，以及金属离子和电子给体对ＭＭＯ催化反应的影响．

外源电子给体对甲烷单加氧酶催化丙烯环氧化反应活性的影响

以丙烯氧化反应为指标研究了不同外源电子给体对甲烷细菌(Methylomonas sp.GYJ30)休止细胞催化活性的影响。结果表明甲烷、甲醇、甲醛和甲酸盐作为电子给体加入反应中,将甲烷单加氧酶催化丙烯环氧化反应活性分别提高5.3,12.7,10和12.4倍。以甲烷和甲醛作为外源电子给体时提高初始浓度对甲烷单加氧酶具有抑制作用;而以甲醇和甲酸盐作为电子给体时提高初始浓度对甲烷单加氧酶催化活性无明显抑制作用。研究了甲醇作为电子给体时它的代谢、环氧丙烷的积累以及催化反应活性与反应时间的关系。

甲烷利用菌催化烯烃环氧化的底物选择性,细胞失活原因及产物对映体组成

研究了甲烷利用菌Methylomonas sp.GYJ3,Methylomonas sp.S,Methylomonaa sp.Z201,Methylococcus capsulatus IMV3021,Methylosinus trichosporium IMV3011休止细胞催化烯烃环氧化的底物选择性,细胞失活原因以及产物对映体组成.发现不同菌株和底物的环氧化活性不同.甲烷利用菌只能催化短链烯烃环氧化,环烯烃和芳香烯烃无反应.对烯丙基型底物而言,取代基大小和极性影响环氧化活性 丙烯环氧化活性最高,烯丙醇不能环氧化.细胞失活的主要原因是环氧化产物的细胞毒性和反应体系中辅酶NADH损耗.手性气相色谱揭示甲烷利用菌催化烯烃环氧化形成外消旋产物.

脂肪酶产生菌的筛选及不对称水解合成S-(+)-萘普生

从 1 6个土样中分离获得一株脂肪酶产生菌E 5 3# ,该菌可优先水解S ( +) 萘普生甲酯为S ( +) 萘普生 ,ee值可超过 87%。该菌经初步鉴定为芽孢杆菌。最佳产酶培养基为葡萄糖 0 .5 %、蛋白胨 0 .5 %、酵母膏 0 .2 %。 0 .5 %的橄榄油 ,能诱导脂肪酶的大量产生。

水-有机溶剂两相体系中甲基单孢菌Z201细胞催化丙烯环氧化的初步研究

水－有机溶剂两相体系中甲基单孢菌Ｚ２０１细胞催化丙烯环氧化的初步研究夏仕文尉迟力李树本（中国科学院兰州化学物理研究所羰基合成与选择氧化国家重点实验室兰州７３００００）Ｌａａｎｅ于１９８７年提出了生物催化剂工程（Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｅｎｇｉｎｅ...

单相和两相发酵体系中Methylomonas Z201细胞的生长和环氧丙烷的合成

研究了单相和两相发酵体系中甲基单胞菌（Methylomonas）Z201细胞的生长和环氧丙烷的合成。在单相发酵体系中，底物丙烯和产物环氧丙烷抑制细胞生长，水相中环氧丙烷的浓度达到13mmol／L。在两相发酵体系中，十六烷作为生长底物甲烷以及反应底物丙烯和分子氧的“储器”，减小了丙烯对细胞生长的抑制作用，水相和十六烷相中环氧丙烷的浓度分别达到1．7mmol／L和2．6mmol／L。同休止细胞相比，单相和两相发酵体系中辅酶NADH的原位再生使生长细胞的操作稳定性显著提高，尤为两相体系为甚。

水-有机溶剂两相体系中甲基单胞菌Z201催化丙烯环氧化的初步研究

水有机溶剂两相体系中甲基单胞菌Ｚ２０１催化丙烯环氧化的初步研究夏仕文尉迟力李树本（中国科学院兰州化学物理研究所羰基合成与选择氧化国家重点实验室兰州７３００００）Ｌａｎｎｅ于１９８７年提出了生物催化剂工程（Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｅｎｇｉｎｅｒｉ...

五氟代锰卟啉模拟酶体系快速混合停流吸收谱

采用快速混合停流技术，在实际反应条件下，考察了五氟代锰卟啉配合物Ｍｎ＾Ⅲ（ＴＦＰＰ）Ｃｌ与两种单氧给体亚碘酰苯ＰｈＩＯ和过氧苯甲酸ｍ－ＣＰＢＡ构建的细胞色素Ｐ－４５０模拟酶体系催化活性物种的生成及催化煅烃环氧化过程。

Mycobacterium E3休止细胞催化烯烃立体选择性环氧化

初步研究了MycobacteriumE3的生长和产酶特性，利用MycobacteriumE3休止细胞催化烷烃羟化和烯烃环氧化．研究结果表明，烷烃不能被羟化，烯烃环氧化具有底物选择性．对烯丙基型底物XCH2CH＝CH2（X＝H、Cl、Br、OH），取代基大小显著影响环氧化活性Mycobac-teriumE3中烯烃单加氧酶和另一种结构未知的酶的存在导致烯烃环氧化过程中存在环氧化物的立体选择性形成和非立体选择性降解两种竞争反应，旋光技术和手性气相色谱揭示MycobacteriumE3催化相应烯烃主要形成（R）-1，2-环氧丙烷和（S）-1-氯-2，3-环氧丙烷。

甲基单胞菌Methylomonas sp.GYJ3中甲烷单加氧酶还原酶组分的纯化和性质

Ｍｅｔｙｌｏｍｏｎａｓｓｐ．ＧＹＪ３菌的甲烷单加氧酶（ＭＭＯ）粗酶提取液经ＤＥＡＥ－ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ－６Ｂ阴离子交换层析、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－１００凝胶过滤层析和ＤＥＡＥ－ＴＳＫｇｅｌＨＰＬＣ分离纯化出ＭＭＯ还原酶组分．经ＨＰＬＣ分析，纯度大于９５％，纯化倍数为４．４，加入至ＭＭＯ羟基化酶和调节蛋白Ｂ的体系中表现比活为２２８ｎｍｏｌ环氧丙烷每分钟毫克蛋白．ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳表明还原酶由一种亚基组成，分子量４２ｋＤ．ＩＣＰ－ＡＥＳ测定还原酶的Ｆｅ含量为１．８３ｍｏｌＦｅ每ｍｏｌ蛋白．ＵＶ－Ｖｉｓ光谱表明还原酶除２８０ｎｍ蛋白质特征峰外在４６０ｎｍ有最大吸收峰，且Ａ２８０ｎｍ／Ａ４６０ｎｍ为２．５０，与其它黄素一铁硫蛋白相似，推测还原酶可能含一个ＦＡＤ辅基和Ｆｅ２Ｓ２中心．在厌氧条件下，还原酶能够和ＮＡＤＨ作用，ＵＶ－Ｖｉｓ光谱分析表明还原酶４６０ｎｍ处特征吸收峰消失，说明在ＭＭＯ催化过程中还原酶接受ＮＡＤＨ的电子．ＤＥＡＥ－ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ－６Ｂ阴离子交换层析分离出调节蛋白Ｂ，部分纯化的调节蛋白Ｂ的分子量大约在２０ｋＤ，它能够提高ＭＭＯ比活性４０倍，ＭＭＯ还原酶和调节蛋白Ｂ单独存在时不具有ＭＭＯ?

甲基单胞菌Methylomonas sp.GYJ3中甲烷单加氧酶羟基化酶组分的纯化和性质

Methylomonassp．GYJ3菌株中经DEAE-SepharoseCL-6B阴离子交换层析和SephacrylS300凝胶层析分离纯化出甲烷加氧酶羟基化酶组分．经HPLC分析，纯度大于90％，分子量为240kD，纯化倍数为3．9，比活为225nmol环氧丙烷每分钟毫克蛋白．SDS-PAGE表明，羟基化酶由三个亚基组成，亚基分子量为56、43、27kD．ICPAES测定羟基化酶的Fe含量为2.1molFe每摩尔蛋白．HPLC法用于甲烷单加氧酶羟基化酶组分的纯化，纯化的羟基化酶组分比活为541nmol（环氧丙烷）每分钟毫克蛋白，是两步LC法纯化的羟基化酶的两倍，Fe含量为3．78molFe每摩尔蛋白．催化性质研究表明羟基化酶能够被化学还原剂还原为还原态羟基化酶，还原态的羟基化酶单独存在时表现出MMO活性，说明它是MMO活性中心，天然态的羟基化酶单独存在时无MMO活性，加入粗酶液中MMO活性明显增加，说明GYJ3菌中MMO是一个复合酶系．

反应器操作方式对酶动力学拆分立体选择性的影响

描述了在批式反应器和连续流搅拌反应器 ( CSTR)中酶动力学拆分对映异构体的不同之处。从宏观反应器平衡角度 ,推导出了在 CSTR反应器中不同于在批式反应器中的一定酶立体选择性 ( E)下 ,底物或产物的对映体过量值 ( ees或 eep)与反应的转化率 (ξ)之间关系的定量关系式。并通过商品脂肪酶 ( candidarugosa lipase)及芽孢杆菌 E- 53脂肪酶催化的萘普生甲酯的不对称水解反应得到了证实。分别在批式反应器和 CSTR反应器中进行萘普生的酶法拆分 ,在一定转化率下 ,批式反应器中得到的底物及产物的对映体过量值高于 CSTR反应器中得到的结果。

细胞色素P-450铁卟啉模拟酶的快速混合停流吸收谱

采用快速混合停流技术 ,在实际反应条件下 ,考察了不同铁卟啉配合物FeⅢ(Por.)Cl(Por.=TPP、TMOPP和TFPP)与单氧给体过氧苯甲酸m CPBA构建的模拟酶体系中催化活性物种的生成及催化烯烃环氧化过程 .在氧给体m CPBA作用下 ,FeⅢ(TPP)Cl和FeⅢ(TMOPP)Cl均生成了四价铁氧卟啉配合物 ,具有较高的催化环氧化活性 ,但存在严重的氧化分解 ;而FeⅢ(TFPP)Cl则生成了一种较稳定的中间体 ,以致催化活性较低 ,但当溶液中含有一定量的甲醇时 ,催化活性将出现大幅度的提高 .

甲烷生物催化氧化制甲醇—甲基球菌3021中甲烷单加氧酶催化性能的研究

甲基球菌３０２１中的甲烷单加氧酶在甲烷生物催化氧化制甲醇的反应中具有重要的作用．实验结果表明，３０２１菌的热稳定性好于其它甲烷氧化细菌，可在４５℃反应５ｈ．在２００ｍｍｏｌ／Ｌ磷酸缓冲液中，它的甲醇累积速率比甲基弯菌ＩＭＶ３０１１高．乙二胺四乙酸（ＥＤＴＡ）、甲酸钠、Ｎａ－Ｃｌ可明显增加甲醇累积量．另外。

外源生长因子对甲烷单加氧酶活性和稳定性的影响

研究结果表明，外源生长因子（维生素Ｂ１２、ｄ－生物素、５－磷酸－吡哆醛、叶酸、原黄素、核黄素）的加入可以使Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ３０１１菌的生长量增加．但添加生物素、吡哆醛和叶酸抑制甲烷单加氧酶和可溶性甲烷单加氧酶酶活性，而维生素Ｂ１２、核黄素和原黄素则明显促进甲烷单加氧酶和可溶性甲烷单加氧酶酶活性，可使甲烷单加氧酶和可溶性甲烷单加氧酶酶活性分别提高４０％左右和１５％－４０％，同时甲烷单加氧酶操作稳定性和贮存稳定性也明显提高１－２倍．