禽腺病毒血清4型fiber-2和penton蛋白亚单位疫苗初步研究及免疫效果评价

选取禽腺病毒血清4型(fowl adenovirus serotype 4,FAdV-4)JLJ13株的fiber-2和penton蛋白作为保护性抗原,利用SWISS-MODEL网站对fiber-2蛋白空间结构进行模拟,截取其主要功能区fiber-2-Shaft 2替代fiber-2,进行密码子优化后,将fiber-2-Shaft 2和penton蛋白基因序列克隆到pET28a(+)载体上并送至北京天一辉远生物科技有限公司进行基因合成,将合成的质粒分别命名为pET-28a-msyb-fiber-2-Shaft 2和pET-28a-msyb-penton。通过原核表达系统进行蛋白表达并使用镍柱纯化。经BCA定量后,用PBS分别将fiber-2-Shaft 2和penton蛋白质量浓度稀释至1000,500,250 mg/L,再将相同质量浓度的fiber-2-Shaft 2和penton蛋白按1∶1体积比混合后作为抗原,配伍ISCOMs佐剂,0.2 mL/只免疫30日龄SPF鸡,即高剂量组免疫fiber-2-Shaft 2和penton蛋白各100μg、中剂量组各50μg、低剂量组各25μg。一免后14 d进行二次免疫,采集二免后7,14,21 d血清检测特异性抗体和中和抗体,并在二免后21 d攻毒。结果显示,成功表达出fiber-2-Shaft 2和penton蛋白,大小分别为69,93 kDa,镍柱纯化后可获得高纯度的蛋白;二免后14 d高中低量组的中和效价依次为1280,640,640,攻毒后阴性对照组表现出明显的临床症状,2~3 d后死亡,疫苗组均未出现任何临床症状。结果表明,利用禽腺病毒血清4型JLJ13株fiber-2-Shaft 2和penton蛋白混合配伍ISCOMs佐剂制备的亚单位疫苗免疫保护效果明显。

环介导等温扩增技术检测产气荚膜梭菌α毒素方法的建立及应用

建立快速检测产气荚膜梭菌的环介导等温扩增(LAMP)方法。针对GenBank发布的产气荚膜梭菌α毒素基因序列,应用Primer explorer V5软件在线设计了LAMP引物。通过对扩增条件包括反应时间、反应温度、Mg^2+浓度、dNTPs浓度、内外引物浓度比、Bst DNA聚合酶浓度进行优化,建立了产气荚膜梭菌LAMP检测方法。特异性试验显示除产气荚膜梭菌外其他细菌检测结果均为阴性,灵敏度试验显示LAMP方法对该菌DNA最低检测量为10 ng/L,菌液的最低检出量为3.7×10^1 CFU/mL,分别是PCR方法的100倍和10倍。用建立的LAMP方法对牛粪便、饲料和饮水共计102份样品进行检测,产气荚膜梭菌阳性率为19.61%(20/102),与PCR检测及细菌分离鉴定结果一致,且样品增菌时间缩短2~4 h。本试验成功建立了快速、灵敏、特异、操作简便和结果可视的产气荚膜梭菌的LAMP检测方法。