北京昌平区和门头沟区古树健康及病虫害调查

【目的】古树具有极大的生态价值意义,通过调查北京市昌平区和门头沟区古树健康状况与病虫害发生情况,掌握两区古树生长现状,为进一步加强古树保护与精细化养护管理工作提供基础数据。【方法】对北京十三陵林场、庆王坟、戒台寺、潭柘寺、妙峰山古树群的古树进行健康状况及病虫害调查。【结果】调查的422棵古树中,81%的古树处于健康状态,腐朽率3.79%,流胶发生率为4.5%,新鲜蛀孔发生率为1.18%。其中国槐、银杏、七叶树、玉兰和元宝枫古树的健康率均为100%。在发生病虫害的古树中,油松古树腐朽率最低,为1.72%、病情指数1.72;白皮松古树流胶率发生最低,为2.86%;油松古树蛀干害虫危害率最低,为0.47%。【结论】北京昌平区、门头沟区古树整体处于健康水平,古树病虫害发生程度与健康等级呈显著相关。

小麦黄花叶病毒人工侵染体系的研究

通过大量的接种实验,分析了影响病毒接种效率的各种因素,经ELISA和RT PCR方法进行检测,确立了较为稳定有效的小麦黄花叶病毒机械传毒体系。采用新鲜病叶或用氯化钙干燥保存的病叶作为接种毒源,在0 2mol·L-1磷酸缓冲液中研磨后,对低温下(11～13℃)培养的小麦幼苗(1～2叶龄)进行叶面接种,并将接种后的小麦低温培养可获得较高的接种效率(12 57%～13 43%)。对毒源类型、小麦苗龄和接种部位等其他可能影响接种效率的因素进行了测定。

叶片保存方法对RT-PCR检测草莓轻型黄边病毒的影响

【目的】探究通过RT-PCR检测草莓轻型黄边病毒最好的叶片保存方法。【方法】经自然风干法、硅胶干燥法以及氧化钙干燥法保存后,采用RNA小量提取试剂盒法提取被病毒侵染草莓叶片总RNA,利用Thermo NanoDrop 2000测定核酸质量浓度和质量并使用RT-PCR方法对SMYEV进行检测。【结果】经氧化钙干燥保存后可提取高质量的RNA,30 d后仍可通过RT-PCR获得扩增产物。【结论】氧化钙干燥保存效果最好,操作简单,成本低,可广泛应用于大量草莓叶片样本的长距离运输,提高草莓病毒检测效率,为草莓无毒栽培提供保障。

百合鳞茎腐烂病病原菌分离鉴定

鳞茎腐烂病是百合贮藏期的重要病害,笔者从北京地区发生的百合典型鳞茎腐烂组织中分离到3种病原真菌,经过对病原菌形态特征和培养性状的观察以及致病性测定等方面的研究,结果表明Penicilliumcyclopium和Rhizopusstolonifer是引起百合贮藏期鳞茎发生腐烂的主要致病菌。

小麦黄花叶病毒的血清学检测

利用间接ELISA对感染WYMV的小麦病叶检测 ,通过比较分析影响ELISA测定结果的包被缓冲液、抗血清及酶标抗体的浓度和种类 ,确立了较为稳定的反应体系。利用此ELISA检测体系并结合RT PCR方法对从四川采集的田间小麦中WYMV进行检测 ,确定了有较高的检测灵敏度的检测系统 ,为田间大量小麦病样的检测提供有效。

全日制农业推广硕士人才培养模式研究与实践——以北京农学院种业领域为例

专业学位研究生的培养目标为培养高层次应用型人才,本研究探索和创新农业推广硕士种业领域人才培养机制,研究并实践了理论教学与实践能力培养并重、增强校企联合培养机制的培养模式。

莴苣花叶病毒北京分离物基因组3'末端序列分析

笔者通过RT-PCR方法对LMV北京分离物(LMV-BJ)基因组3'端1620nt的核苷酸片段进行了克隆和序列分析(GenBank登录号为EF423619)。所获片段含有NIb基因3'端的574nt,编码NIb C-端190个氨基酸;完整的CP基因,全长为834nt,编码一个由277个氨基酸组成的分子量约为30kDa的结构蛋白;3'非编码区含有209nt。通过序列分析软件将LMV-BJ与已经报道的法国分离物O(X97704)、法国分离物E(X97705),美国分离物(X65652),巴西分离物(AJ278854)和余杭分离物(AJ306288)基因组3'末端和CP基因的核苷酸序列与氨基酸序列分别进行了比较。

11种杀菌剂对设施草莓白粉病的防治效果

为了筛选出防治设施草莓白粉病的高效杀菌剂,选择11种杀菌剂结合清除病残体进行田间药效试验,以期为大田草莓白粉病防治提供参考依据。试验结果表明:在清除病残体的情况下,不同杀菌剂对草莓白粉病均有一定程度的抑制作用,其中25%乙嘧酚磺酸酯微乳剂在3次用药后防效逐渐增加,至第3次药后7 d在所有药剂中防效最好,达到79.90%;66.8%嘧霉胺悬浮剂药效的速效性和持续性好,在第1、2次施药后7 d防效均为第1,均显著高于其他处理;丙烯酸酯类杀菌剂25%乙嘧酚悬浮剂表现出良好的速效性和持续性,前2次施药后7 d防治效果均在70%以上,显著高于除66.8%嘧霉胺悬浮剂以外的其他药剂处理;除30%氟菌唑可湿性粉剂有轻微药害产生,其余各供试药剂按照试验浓度施药,草莓生长安全、无药害产生。

3种生物农药对保护地番茄常见病害的室内药效测定

为了减少使用化学农药带来的环境污染,病害产生抗药性以及番茄的农药残留问题,目前生产上迫切需要生物农药的推广和使用。笔者利用生长速率抑制法测定了3种生物农药对5种常见的保护地番茄病害的室内抑菌作用,测试药剂为植物源杀菌剂:10%霉菌消,60%灰霉散和60%霜霉散。结果表明,3种生物药剂对5种保护地番茄病害均有一定的抑制效果,其中10%霉菌消对番茄早疫病菌的抑制率为63 0%,60%灰霉散对番茄根腐病菌的抑制率为61 1%,60%霜霉散对番茄根腐病菌的抑制率达到76 4%。

草莓轻型黄边病毒RT-LAMP检测方法的建立

【目的】草莓轻型黄边病毒(Strawberry mild yellow edge virus,SMYEV)是侵染草莓的重要病毒,严重影响草莓果实的产量和品质。研究旨在建立利用反转录等温扩增技术(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)检测SMYEV的方法。【方法】根据SMYEV外壳蛋白基因3′端保守序列设计4个特异性引物SMYEV-FIP(5′-CAGATCAGCGACAATTTGGACTCCTGAGGAACTTGCTGCT-3′)、SMYEV-BIP(5′-GCTTTGTC GGGGATCCTGGGAAGGCTAAGTCGAAGAGACC-3′)、SMYEV-F3(5′-TCAAGTTGGTGACCCTTTCC-3′)和SMYEV-B3(5′-CGAGGAAC CAATGTCGTAGC-3′)。对RT-LAMP检测体系中的条件进行优化,设置反应温度为60、61、62、63、64、65℃,反应时间为30、45、60、75 min,分别设置引物SMYEV-FIP/BIP浓度为1.0、1.2、1.4、1.6、1.8μmol·L-1,引物SMYEV-F3/B3浓度0.1、0.15、0.2、0.25、0.3μmol·L-1,设置Mg2+浓度为2、4、6、8、10 mmol·L-1,d NTPs浓度为0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mmol·L-1,betaine浓度为0、0.4、0.8、1.0、1.2、1.4 mol·L-1,DTT浓度为2.0、2.4、2.8、3.2、3.6、4.0μmol·L-1等,并对以上不同反应条件进行检测,确定优化后的RT-LAMP检测体系。选用其他常见的草莓病毒以及健康草莓植株叶片中的RNA作为模板,对RT-LAMP体系的特异性进行测定;将SMYEV的RNA进行10倍梯度逐级稀释,分别获得RNA原液、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6和10-7不同稀释液作为模板,比较RT-LAMP和RT-PCR的检测灵敏度。RT-LAMP反应产物可以进行电泳和紫外成像检测,阳性样品出现瀑布状条带,阴性样品无条带,或者在反应产物中加入SYBR green I核酸染料,直接观察检测,阳性样品为绿色,阴性样品为橙色。【结果】建立了一种特异性检测SMYEV的RT-LAMP方法,经过各反应条件优化后的检测体系为1.0μmol·L-1SMYEV-FIP/BIP、0.1μmol·L-1 SMYEV-F3/B3、4 mmol·L-1 Mg2+、1.6 mmol·L-1 d NTPs、0.4 mol·L-1 betaine、2.0μmol·L-1DTT,60℃反应45 min。选用SMYEV、草莓镶脉病毒(Strawberry vein banding virus,SVBV)、草莓斑驳病毒(Strawberry mottle virus,SMo V)和草莓皱缩病毒(Strawberry crinkle virus,SCV)的RNA以及健康草莓植株叶片中的RNA作为模板进行RT-LAMP的特异性检测,结果显示仅有SMYEV的RNA能够扩增出瀑布型条带,建立的RT-LAMP检测体系有很好的特异性。将SMYEV的RNA原液、10-1、10-2、10-3稀释液作为模板进行RT-PCR反应后,检测结果为阳性,随着模板稀释倍数的增加,电泳检测不能观察到RT-PCR的扩增产物。而进行SMYEV的RT-LAMP检测时,RNA原液、10-1、10-2、10-3、10-4和10-5稀释液作为模板时,均可以观察到阳性结果。RT-LAMP检测SMYEV比RT-PCR方法检测的灵敏度高100倍,并且比RT-PCR节省时间,检测结果容易判定。【结论】RT-LAMP方法能快速、简便、特异地检测SMYEV,供科研部门和基层生产单位使用,在种苗繁育、田间调查和海关检疫的过程中进行快速检测。

两株解淀粉芽胞杆菌对西瓜枯萎病的防治作用及其相关生防因子检测

本试验从西瓜枯萎病生物防治实际需要出发,检测了两株解淀粉芽胞杆菌TR2和CE对西瓜枯萎病的防治作用及其相关的生防因子。平板对峙试验显示生防菌TR2和CE对西瓜枯萎病尖孢镰刀菌Xg-1、Xg-2和腐皮镰刀菌Xg-3的生长有较强的抑制作用,其中TR2对Xg-1的抑菌效果最好,抑菌带宽度为4.7 mm,CE对Xg-3的抑菌效果最好,抑菌带宽度为5.0 mm,抑菌圈边缘菌丝出现变细、扭曲、个别细胞膨大成球形等畸形现象。幼苗接种试验表明生防菌TR2和CE对西瓜枯萎病的发生具有防治效果,其中TR2对Xg-1在第15 d时防病效果最好,病情指数明显降低,其防治效果达到60%;TR2和CE对Xg-3在第3 d时表现很好的防病效果,发病率和病情指数都明显低于对照,防治效果可达63.6%。采用结晶紫染色、钼锑抗比色法、四苯硼钠法和透明圈检测等方法检测TR2和CE的相关生防因子,发现TR2和CE均可以形成生物膜、分解有机磷、无机磷和钾矿石,并且具备产生蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶的能力。采用水培法发现TR2和CE的解磷解钾能力可以促进西瓜幼苗根和茎的生长。结果表明生防菌TR2和CE可以控制西瓜枯萎病的发生、形成生物膜在西瓜根系定殖,促进西瓜幼苗生长,是具有开发潜力的生防菌株。

草莓根腐病菌C16-4的分离鉴定及生物学特性研究

【目的】针对近年来设施草莓根腐病普遍发生并逐年加重的现状，明确北京地区引起设施草莓根腐病的主要致病真菌的种类。【方法】以草莓根腐病（Strawberry root rot）为研究对象，采用组织分离法，从病株上共分离纯化得到5个菌株，对主要致病菌C16—4进行了鉴定和生物学特性研究。【结果】结果表明，最利于C16—4生长和产孢的培养基为PDA：最佳氮源为蛋白胨．最佳碳源为麦芽糖和淀粉。菌丝在10—35℃均可以生长，在本试验所设温度范围内，最适生长和产孢的温度分别为25℃和30℃。菌丝在pH值为5～7时均可以生长，最适pH值为7，中性条件下利于产孢。不同光照条件对菌丝生长影响不明显，在全黑暗情况下产孢量最大。【结论】通过培养性状、形态特征、致病性测定结果和ITS序列分析，将C16—4鉴定为尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporium Schlecht）。

6种常用杀菌剂对木霉菌生长发育的影响

研究了6种常用杀菌剂对木霉菌生长的影响。结果表明,不同类型杀菌剂和同一种杀菌剂不同使用浓度对木霉菌生长的影响存在着显著差异,其中甲基托布津,多菌灵和百菌清稀释200、400、600、800、1000倍时,对木霉菌的抑制率均为100%。农利灵和甲霜灵对木霉菌的抑制作用较弱,稀释200倍时,抑制率分别为89.7%和79.6%。大生对木霉菌的抑制作用则最弱,稀释200倍时,抑制率仅为55.3%。

三株拮抗细菌的鉴定及抑菌作用研究

为了充分发掘和利用有益微生物资源,本文以草莓根腐尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum为靶标菌,从草莓根际土壤中分离筛选得到3株拮抗细菌,通过培养性状与形态特征、生理生化特征以及16S rDNA同源序列比对分析进行了鉴定,菌株1-9和9-4为多粘类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa、菌株12-4为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis。这3株细菌对草莓根腐尖孢镰刀菌的抑菌作用进行了初步的研究,结果表明,3株拮抗细菌对草莓根腐尖孢镰刀菌的生长有很好的抑制作用,镜下观察对菌丝有致畸作用,其培养滤液还能够抑制草莓根腐病尖孢镰刀菌分生孢子的产生与萌发。

番茄黄化曲叶病毒的鉴定与群体进化分析

番茄黄化曲叶病(tomato yellow leaf curl disease,TYLCD)是番茄上的重要病害,可由多种双生病毒引起。为了明确北京地区番茄黄化曲叶病的病毒种类和病毒基因组变异情况,本研究收集了51个采自北京不同区县的病毒疑似样品,进行了双生病毒的检测及分离物的基因组分析。经双生病毒简并引物检测25个样品呈阳性;扩增获得10个代表性分离物的全基因组,大小均为2 781bp,共含有6个开放阅读框;经比对,10个分离物与Tomato yellow leaf curl virus-Israel(TYLCV-IL)同源率大于99%;基于我国TYLCV分离物全基因组序列的变异分析表明,TYLCV在进化上比较保守,整个基因组上的变异是不均匀的;系统发育树显示我国TYLCV分离物在进化树上可分为3个组群,分析了我国TYLCV群体进化情况。

解淀粉芽孢杆菌产抗菌物质发酵工艺研究

解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）BJ-6发酵过程中可产生对多种植物病原真菌有抑菌作用的抗菌物质,为提高该菌株抗菌物质的产量,收集到应用于芽孢杆菌发酵的培养基配方18种,通过摇床培养筛选出较适宜于解淀粉芽孢杆菌BJ-6发酵的培养基7种。在此基础上,利用2号培养基对该菌株进行了5L发酵罐的发酵培养,并采用不同生化检测方法测定了发酵过程中菌体数量、蛋白产生量、碳源和氮源的消耗量随发酵时间的动态变化情况,明确了最佳发酵时间为96h以及碳氮源的补加时间为开始发酵后的8～12h。同时,发酵罐自动记录了发酵过程中pH值和溶氧的动态变化。

基于小RNA深度测序技术鉴定侵染我国部分省市草莓种苗的病毒种类

随着草莓保护地栽培面积的增加和无性繁殖种苗的繁殖与调运,草莓病毒病的发生与流行日益严重。为明确侵染我国部分省市草莓种苗的病毒种类,应用小RNA深度测序技术进行检测,并利用RT-PCR技术对结果进行验证及序列分析。结果表明,从来自我国7省市的41株具有典型病毒病症状的草莓种苗样品中检测到草莓斑驳病毒strawberry mottle virus(SMoV)、草莓镶脉病毒strawberry vein banding virus(SVBV)和草莓轻型黄边病毒strawberry mild yellow edge virus(SMYEV)3种。SMoV、SVBV和SMYEV的检出率分别为34.1%、24.4%和2.4%。选取不同产地草莓种苗上检出的不同病毒进行部分序列测定和分析,获得了3个SMoV分离物(四川分离物schhy13、辽宁分离物lnhy23和河北分离物hbhy28)的部分RNA13′端非编码区606 bp核苷酸序列,其一致性为98.12%~99.34%。测定并获得了5个SVBV分离物(辽宁分离物lnhy15、lnhy17、lnhy24、河北分离物hbhy28和陕西分离物shaxhy35)的ORF6的部分基因及其5′端非编码区的核苷酸序列,其中部分ORF6基因序列的一致性为97.98%~99.8%。仅1个辽宁样品中检测到SMYEV,获得了辽宁分离物lnhy26,其CP基因序列与中国甘肃分离物sy02的一致性为99.02%。病毒侵染草莓植株产生的典型症状有叶片畸形、变色和植株矮化。存在2种病毒和3种病毒复合侵染的情况,占所有阳性样品的41.2%。辽宁和河北的‘红颜’种苗中检出SMoV和SVBV或SMoV、SVBV和SMYEV的复合侵染情况;四川和陕西的‘红颜’种苗仅检出SMoV或SVBV,而其他省市和品种均未检出病毒。研究结果可以为草莓病毒的检测以及草莓病毒病的科学防治提供依据。

北京昌平地区草莓根腐病菌种类鉴定

明确草莓根腐病的主要致病真菌种类,可正确有效地指导草莓根腐病的防治。本试验采用单孢分离法和组织分离法从昌平地区所采集的草莓根腐病株中共分离得到41个菌株。采用病土定植法测定菌株对草莓幼苗的致病性,结果表明所分离的菌株均可引起草莓根腐病,致使草莓根部及根茎基部发育受阻,缢缩变黑,腐烂折断;造成地上部生长不良,叶片变黄,甚至死亡。通过形态学、分子生物学手段对菌株的分类地位进行鉴定,其中39株可以鉴定到种,分别属于10个属的15个种,另外有1株只鉴定到属,1株只鉴定到科。在41个菌株中,立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)、木贼镰刀菌(Fusarium equiseti)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)等4个种所占比例较高,分别占菌株总量的29.25%、12.20%、12.20%、9.75%;致病力最强的种类为伏革菌科真菌、棒形拟盘多毛孢和胶孢炭疽菌,其次为尖孢镰刀菌、立枯丝核菌、木贼镰刀菌、茄病镰刀菌,发病率均可达50%;淡色生赤壳、伏革菌科菌、Plectosphaerella cucumerina、Stachybotrys chartarum、Neonectria radicicola等为首次报道的草莓根腐病致病菌。研究结果可以指导北京昌平地区草莓主产区中草莓根腐病的防治,并为草莓根腐病快速检测方法的研发提供参考。

新病害草莓褐色叶斑病病原菌细胞壁降解酶研究

草莓褐色叶斑病是中国新发现的一种病害,造成叶片坏死和果实腐烂。为明确该病原菌的致病机理,对草莓褐色叶斑病菌产生的细胞壁降解酶进行研究。采用3,5-二硝基水杨酸法(DNS法)和紫外分光光度计法测定该病原菌产生的细胞壁降解酶的种类和活性。结果发现,该病原菌能够产生多种细胞壁降解酶,即多聚半乳糖醛酸酶(PG)、果胶甲基半乳糖醛酸酶(PMG)、多聚半乳糖醛酸反式消除酶(PGTE)和果胶甲基反式消除酶(PMTE),但不产生纤维素酶(Cx),其中PG和PMG活性较强,且PG和PMG在培养6天时活性最强,PMG在23℃条件下培养时活性最强,PG在28℃条件下培养时活性最强,静止和振荡交替培养有利于PG和PMG的产生。致病作用研究发现,果胶酶(PG和PMG)可引起果实腐烂和叶片坏死,说明其在该病原菌的致病过程中起重要作用。

草莓轻型黄边病毒北京分离物的CP基因序列分析

为了明确引起北京地区草莓病毒病的病毒种类和病毒序列的分子变异特点,从北京地区表现畸形症状的草莓叶片中提取总RNA,利用RT-PCR技术扩增得到草莓轻型黄边病毒（Strawberry mild yellow edge virus,SMYEV）的含有外壳蛋白（CP）基因的729 nt特异性核苷酸片段。经序列测定和分析可知,北京地区存在2种不同的SMYEV分离物（BJ1和BJ2）,两者间的核苷酸序列同源性仅为82.72%~82.96%。将北京分离物与分别来自德国、美国、智利、捷克、澳大利亚、比利时、意大利、韩国和中国沈阳等国家或地区的不同分离物的CP基因序列进行分析比较。结果显示,33个分离物可以分为四大组群,BJI和BJ2分别归属不同组群,BJ1与19个其他国家的分离物亲缘关系较近,BJ2与中国沈阳的2个分离物亲缘关系较近。BJ1和BJ2与其他分离物的CP基因核苷酸序列同源性分别为81.10%~98.35%和82.03%~98.63%,氨基酸序列同源性介于82.17%~99.17%和90.91%~94.63%。