蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)全长转录组测序及分析

为了深入分析和探索豆科模式植物蒺藜苜蓿的mRNA完整结构,使用单分子长读数测序技术(single-molecule long-read sequencing technology,SMRT)对蒺藜苜蓿进行全长转录组测序及分析。共获得7 728 183个subread和509 014条全长非嵌合序列(full-length non-chimeric read,FLNC),通过比对分析发现,94.36%的序列与93.01%的序列分别与蒺藜苜蓿R108与A17参考基因组匹配。总计存在8 406种可变性剪接,其中主要的剪接方式为内含子保留(intron retention,RI)。共发现23 926个基因,其中12 049个基因存在295 545条转录本,在这些转录本中至少存在一个poly(A)位点。此外,共鉴定出3 223条转录因子,6 595条长非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)和479条融合转录本。使用SMRT技术能够深入发掘蒺藜苜蓿转录数据,也为更好地利用蒺藜苜蓿基因组资源提供数据补充。

蒺藜苜蓿细胞分裂素响应调节因子ARR9自激活检测及表达分析

细胞分裂素响应调节因子ARR在植物细胞分裂素信号转导过程中扮演重要角色。以豆科模式植物蒺藜苜蓿R108为材料,采用RT-PCR技术克隆蒺藜苜蓿ARR9基因,通过生物信息学分析、酵母转录自激活检测、原核表达及表达特征分析,探究蒺藜苜蓿ARR9基因功能。结果表明:蒺藜苜蓿ARR9基因编码区全长501bp,编码167个氨基酸,分子量18.95kD,理论等电点为6.21。生物信息学分析表明,ARR9可能参与转录调控、响应细胞分裂素及红光、细胞分裂素磷酸化信号转导及昼夜节律等过程。进化分析表明,蒺藜苜蓿ARR9蛋白与鹰嘴豆ARR蛋白亲缘关系最为接近。蒺藜苜蓿ARR9无转录自激活活性。在大肠杆菌Rosetta(DE3)中成功诱导蒺藜苜蓿ARR9蛋白表达,融合蛋白大小在25kD左右,Western Blot证实ARR9蛋白表达成功。蒺藜苜蓿ARR9基因在根中表达量最高,其表达受ABA的抑制,受IAA的短期(2~12h)抑制。

蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)叶片衰老的转录组分析

为探究蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)叶片衰老过程中相关基因的分子机制及代谢通路,本研究以其成熟叶片和衰老初期、中期、末期叶片为研究对象。通过转录组测序,比较4个发育阶段样品之间的转录组差异。结果表明,与成熟叶片相比,共筛选出2990个差异表达基因(DEGs),在所有衰老样本中表达水平均发生显著变化,其中有2684条(89.77%)可进行基因功能注释;同时利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)结果证实了转录组测序的可靠性。进一步分析发现,DEGs涉及高等植物转录因子33个家族,包括ERF、WRKY、bHLH、MYB、NAC和bZIP。此外,还发现了837个与叶片衰老相关的基因。本研究发现了蒺藜苜蓿叶片衰老过程中大量差异表达的基因,为进一步分析蒺藜苜蓿叶片发育和衰老的调控机制提供参考。

紫花苜蓿转录因子基因MsAP_(2)的克隆及转化

紫花苜蓿(Medicago sativa)为重要的豆科牧草植物,研究紫花苜蓿转录因子基因MsAP_(2)的功能,为探究MsAP_(2)的信号转导网络提供理论指导和材料基础,也为紫花苜蓿生物技术育种提供一定的参考和借鉴。运用RT-PCR技术克隆MsAP_(2),利用DNA重组技术构建3302-3flag-AP_(2)植物表达载体,并利用农杆菌介导法对紫花苜蓿进行遗传转化,对再生植株进行转基因鉴定、基因表达量分析、内源激素的测定(脱落酸、细胞分裂素、生长素和赤霉素)和表型鉴定。结果表明,成功获得转MsAP_(2)紫花苜蓿植株,与野生型相比,转基因植株的MsAP_(2)表达量和激素水平均发生明显改变,转基因植株呈现早衰性状,叶片形态和大小发生改变,根系生长受到抑制,分枝数发生改变。

紫花苜蓿ARR基因克隆及转化

细胞分裂素响应调节因子ARRs(Arabidopsis response regulators)在细胞分裂素的信号转导过程中发挥极为重要的作用。紫花苜蓿(Medicago sativa)作为一种重要的多年生优质牧草植物,在我国草产业中地位显著,越来越受到科研工作者的关注。为研究紫花苜蓿ARR基因功能,采用RT-PCR技术成功克隆ARR基因。采用农杆菌(Agrobacterium tumefacien)转化法将成功构建的3302-ARR-3Flag植物表达载体导入野生型紫花苜蓿,并成功获得9株紫花苜蓿转基因植株。与野生型相比,转基因紫花苜蓿分枝数多,复叶数目异常,为深入研究ARR基因功能提供原始实验材料。

日本结缕草ZjTCP4基因的克隆、转录自激活检测及表达模式分析

TCP家族蛋白是植物中一种特有的转录因子,在植物的发育过程中起着重要的作用。本研究从日本结缕草(Zoysia japonica)中克隆ZjTCP4基因(GenBank登录号:MZ540773),该基因完整编码区为2097 bp,编码699个氨基酸。进化树及保守序列分析显示,ZjTCP4蛋白含有TCP家族高度保守的螺旋-环-螺旋的TCP结构域,与玉米(Zea mays)中的ZmTCP4蛋白同源关系最高,且具有相似的保守基序构成,属于TCP转录因子家族中的CIN亚类。酵母自激活检测结果显示,ZjTCP4不具备自激活活性,可进行后续酵母双杂交实验及互做蛋白检测分析。ZjTCP4基因表达模式分析显示,其在结缕草衰老叶片及根系中的表达量较高。对ZjTCP4蛋白的烟草(Nicotiana tabacum)亚细胞定位实验显示,该蛋白定位于细胞质内。本研究为进一步研究日本结缕草ZjTCP4蛋白及TCP转录因子家族提供了科学依据。