miRNA对褐飞虱鞘脂质代谢基因表达的影响及沉默NlSPT1和Nl SMase4的small RNA分析

【背景】鞘脂质是第二大类膜脂,作为信号转导物质参与细胞生长发育、繁殖及凋亡等过程。鞘脂质代谢酶调控鞘脂质代谢以维持生物体内代谢的稳态。【目的】以重要水稻害虫褐飞虱(Nilaparvata lugens)为研究对象,通过RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术检测微小RNA(microRNA,miRNA)生物合成通路核心组分NlAgo1、NlDicer1和NlDrosha沉默后褐飞虱鞘脂质代谢通路相关基因的相对转录水平,结合small RNA测序分析沉默丝氨酸棕榈酰转移酶1(serine palmitoyltransferase 1,SPT1)和鞘磷脂酶4(sphingomyelinase 4,SMase4)基因的差异miRNA,探究miRNA在褐飞虱鞘脂质代谢中的作用,为害虫防治提供新的分子靶标。【方法】利用RNAi技术,分别对羽化后第1天(1 PAE,post adult eclosion)的雌成虫NlAgo1、NlDicer1和NlDrosha进行dsRNA注射,以ds GFP为对照;分别解剖羽化后第5天的卵巢组织,以β-actin作为内参基因,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法检测NlAgo1、NlDicer1和NlDrosha沉默后鞘脂质代谢通路相关基因的表达量变化;根据已有的小RNA文库联合miRNA-靶基因预测软件对可能调控NlSPT1和NlSMase4表达的miRNA进行预测;通过small RNA测序技术对沉默NlSPT1和NlSMase4的差异miRNA进行鉴定和靶基因富集性分析。【结果】与对照组相比,沉默NlAgo1、NlDicer1或NlDrosha显著上调卵巢中NlSPT1和NlSMase4等鞘脂质代谢通路相关基因的表达;靶基因预测结果显示,有6条miRNA能与NlSPT1结合,13条miRNA能与NlSMase4结合;沉默NlSPT1和NlSMase4的差异miRNA的靶基因显著富集在细胞核和蛋白质结合等生物学过程以及内吞作用、内质网加工、MAPK信号通路、TOR信号通路、凋亡、脂质代谢等代谢通路。【结论】NlAgo1、NlDicer1和NlDrosha依赖性的miRNA通过影响鞘脂质代谢相关基因的表达影响鞘脂质代谢。NlSPT1和NlSMase4沉默引起褐飞虱卵巢miRNA表达水平的改变。研究结果可为基于鞘脂质代谢基因为靶标的害虫防治提供理论依据。

褐飞虱五个miRNA的克隆鉴定与表达谱分析

【目的】本研究对前期鉴定所获得的5个微小RNA(microRNA, miRNA)进行表达和序列验证,检测其在褐飞虱Nilaparvata lugens不同发育阶段和成虫组织中的表达模式,旨在为探究miRNA调控褐飞虱生长发育和繁殖的作用机制提供理论和实验依据。【方法】采用Stem-loop RT-PCR对褐飞虱5个miRNA(miR-1a-3p, miR-71-3p, miR-184-3p, miR-190-5p和miR-281-5p)进行表达验证。结合Sanger测序验证5个miRNA。利用qRT-PCR检测这5个miRNA在褐飞虱不同发育阶段(卵、 1-5龄若虫和雌雄成虫)、 1-5日龄雌成虫和雌成虫组织(头、胸、腹、足、翅、中肠、马氏管和卵巢)中的表达量。通过注射miRNA类似物agomir和抑制剂antagomir对褐飞虱雌成虫这5个miRNA分别进行过表达和抑制分析。【结果】Stem-loop RT-PCR和Sanger测序结果显示miR-1a-3p, miR-71-3p, miR-184-3p, miR-190-5p和miR-281-5p在褐飞虱体内真实存在和表达。发育表达谱分析发现,miR-1a-3p和miR-71-3p在褐飞虱整个发育阶段均有不同程度的表达,且分别在雄成虫和2龄若虫中高表达;miR-184-3p和miR-281-5p在褐飞虱雌雄成虫中表达量最高,在卵和若虫中表达量较低,且在卵和若虫间的表达量无显著差异;miR-190-5p在卵中表达量显著高于其他发育阶段的。miR-1a-3p的表达量在雌成虫4日龄时显著降低;miR-71-3p和miR-184-3p的表达量在雌成虫3日龄时达到最高;miR-190-5p和miR-281-5p在雌成虫1日龄时的表达量较高,在2-4日龄时的表达量显著下降。组织表达谱分析发现,miR-1a-3p在足部和卵巢中显著高表达;miR-71-3p主要在雌成虫卵巢特异性地高表达;miR-184-3p在中肠中表达量最高,其次是在卵巢中的表达量;miR-190-5p和miR-281-5p均在翅中表达量最高,其次是在头和胸中(miR-190-5p)以及中肠和卵巢中(miR-281-5p)。注射miRNA类似物后,5个miRNA的表达量均比阴性对照显著上调;注射miRNA抑制剂后,除miR-281-5p表达量比阴性对照显著上调外,其余4个miRNA的表达量均比阴性对照显著下调。【结论】这5个miRNA可能在褐飞虱生长发育和繁殖中起调控作用,研究结果为后续开展褐飞虱miRNA功能研究提供了基因参考和基础前提。