慢性疼痛基因治疗的研究现状和进展

慢性疼痛的形成机理极其复杂，已有的治疗手段如药物治疗、针灸治疗和交感神经切除术的长期效果都很差。基因治疗(gene therapy)是20世纪90年代发展起来的一种先进的治疗手段，主要有两种方式，一类为基因矫正和置换，另一类为基因修补。前者是指对缺陷基因的修复或通过同源重组置换缺陷基因，

一种新型的基因开关－RU486诱导调控系统

RU486诱导调控系统是一种新型的基因开关，1994年mh Wang等提出。近十年来已有很多研究对RU486调控系统的结构进行了多方面的改进，将这一调控系统已经用于单纯疱疹病毒、腺病毒、果蝇和转基因动物等方面。本文将按照这一系统的结构、功能、特点和应用予以综述。

鞘内注射入β-内啡肽基因重组腺病毒对慢性神经病理痛大鼠的镇痛作用

目的观察鞘内注射入β-内啡肽(β-EP)基因重组腺病毒(Ad-NEP)对慢性神经病理痛大鼠的镇痛作用。方法36只雄性SD大鼠,体重210-260 g,随机分为手术组(n=26)、假手术组(n= 5)、空白对照组(n=5),手术组分为三个亚组:Ad-NEP组(n=9)、绿色荧光蛋白基因重组腺病毒(Ad- GFP)组(n=9)、生理盐水组(n=8)。大鼠腹腔注射氯胺酮100 mg/kg和阿托品50 mg/kg麻醉后,手术组构建大鼠坐骨神经慢性捆扎(CCI)模型,假手术组进行同样手术,但不捆扎坐骨神经,空白对照组不进行手术;手术组经L5,6间隙蛛网膜下腔置入PE-10导管,7d后分别注射1×108pfu的Ad-NEP、Ad- GFP和40μl生理盐水。于手术后7 d(T0)、鞘内注射前当日(T1)、注射后1 d(T2)、1周(T3)、2周(T4)、3 周(T5)、4周(T6)、5周(T7)分别测定五组大鼠的左右足热痛阈;T3时取Ad-NEP、Ad-GFP组大鼠各1 只,取脊髓L3-6段作免疫组化检测;鞘内注射后10 d取Ad-NEP、Ad-GFP组大鼠,经腹腔内注射1 mg/kg 纳络酮,每间隔10min记录右足热痛阈(t0-9,共观察90min),并分别测定这两组T1-7时的脑脊液内β- EP浓度。结果Ad-GFP组和生理盐水组大鼠右足热痛阈明显低于假手术组和空白对照组(P< 0.01)。Ad-NEP组在T0,1,7时右足热痛阈明显低于假手术组和空白对照组(P<0.01),在T2-6时的右足热痛阈高于T0,也高于Ad-GFP组和生理盐水组(P<0.05或0.01),t1-6时右足热痛阈低于t0时(P< 0.01),与Ad-GFP组和生理盐水组比较差异无统计学意义(P>0.05)。Ad-NEP组脊髓外膜可见明显的橙黄色浓染带,后角区可见少量橙黄色细胞,T2-7时脑脊液内β-EP浓度均高于Ad-GFP组(P< 0.01。)结论鞘内注射重组腺病毒Ad-NEP对慢性神经病理痛大鼠有明显的镇痛效果,作用时间长达4周以上。

两种麻醉方法下食道癌根治术患者单肺通气期间肺内分流的比较

目的比较食管癌根治术患者异丙酚-瑞芬太尼靶控静脉麻醉与异氟醚麻醉下单肺通气(OLV)期间肺内分流的变化。方法择期行中、下段食管癌左侧开胸切除术患者24例,年龄42- 69岁,ASA Ⅰ或Ⅱ级。随机均分为2组:异丙酚-瑞芬太尼组(PR组)和异氟醚组(ISO组)。PR组靶控输注异丙酚和瑞芬太尼,血浆靶浓度分别为3．2μg/ml和4．5μg/ml;ISO组吸入异氟醚(呼气末浓度为 1．5％-2．5％),间断静脉注射芬太尼2μg/kg。持续监测ECG、平均动脉压(MAP)、SpO2、听觉诱发电位指数(AAI)、心脏指数(CI)、气道压(Paw)。麻醉诱导后,插入右双腔支气管导管,分别于平卧位漂浮导管置入后10min(T0)、右侧卧位双肺通气10min(T1)、单肺通气15、30、60、90min(T2-T5)进行动脉血及混合静脉血血气分析,计算肺内分流率(Qs/Qt)。结果两组术中AAI均低于30,PaCO2、pH在正常范围内,组间各时点AAI、PaCO2、pH和Paw比较差异无统计学意义。与T0相比,两组T2-5时Paw升高, T1-5时Qs/Qt增加,于T2达到高峰;PaO2降低,于T2降至最低(P<0．05),而CI差异无统计学意义(P >0．05)。与ISO组比较,T2-5时PR组Qs/Qt降低(P<0．05),PaO2差异无统计学意义。结论与异氟醚麻醉比较,异丙酚-瑞芬太尼麻醉在OLV期间可减少食管癌根治术患者肺内分流,但对PaO2的影响不明显。

肝移植术病人胰岛素复合葡萄糖预先给药对新肝再灌注后高钾血症的作用

高钾血症是原位肝移植手术中常见的并发症,而新肝再灌注即刻血钾可高达7～8mmo1儿以上,尤其在病人肾功能不全的情况下临床表现更凶险[1],可导致严重的心律失常,甚至发生心跳骤停.因此,防治再灌注后高钾血症对于肝移植麻醉管理尤为重要.胰岛素复合葡萄糖能降低健康人和肾衰病人的血钾水平[2],但肝功能失代偿的病人常有"胰岛素抵抗"[3],而且胰岛素能否控制新肝再灌注后的高钾血症尚无定论.本研究拟通过观察无肝期预先应用胰岛素和葡萄糖对新肝再灌注后血钾水平的影响,为临床治疗提供理论依据.

重组腺病毒介导LacZ基因在大鼠肺脏的表达

目的探讨重组腺病毒介导的β-半乳糖苷酶（LacZ）基因在大鼠肺脏的转基因表达。方法Wistar大鼠70只，随机分为Ad—Null组和Ad-LacZ组（n=35），分别应用1．67×10^9pfu/ml复制缺陷型重组腺病毒AdCMV和AdCMVLacZ各600μl，经气管导管滴入；各组于滴入病毒后2、5、7、14、21、28和35d行肺组织X-gal染色。另取大鼠20只，随机分为C组、L组、M组和H组（n=5），分别应用病毒保存液和低滴度（1．67×10^8pfu／ml）、中滴度（1．67×10^9pfu／ml）、高滴度（5×10^9pfu／ml）的AdCMVLacZ各600μl，滴入病毒后7d行肺组织X-gal染色和HE染色。结果滴入病毒后2d，Ad-LacZ组肺组织内即有转基因表达，滴入后7d达高峰，并维持至35d；转基因表达位于气管、支气管上皮细胞和肺泡细胞。H组、M组转基因阳性细胞率明显高于L组和C组（P〈0．01）。HE染色显示，H组中3只大鼠肺组织有轻度炎性浸润。所有动物均未见远隔器官转基因表达。结论气管内滴入重组腺病毒可呈剂量依赖性介导LacZ基因在大鼠肺内表达，但过高剂量可诱发机体炎性反应。

巯基化合物对内毒素诱导大鼠枯否细胞NF-κB活性和肿瘤坏死因子释放的影响

目的观察巯基化合物对内毒素诱导大鼠枯否细胞(KC)NF-κB活性和肿瘤坏死因子-α (TNF-α)释放的影响。方法采用胶原酶灌注和percoll密度梯度离心法分离得到高纯度大鼠KC,在过夜培养后冲洗两遍(不含血清),加入内毒素(LPS)10ng／ml刺激原代培养的KC,观察不同浓度谷胱甘肽乙基酯(GSHEE)及N-乙酰半胱氨酸(NAC)对大鼠KC TNF-α释放和KC内谷胱甘肽(GSH)及NF- κB活性的影响。并观察使用谷胱甘肽合成抑制剂BSO后,对NAC抑制炎症因子的影响,采用凝胶滞留电泳法测NF-κB活性,采用高效液相色谱分析法测GSH水平。结果 LPS诱导KC中GSH水平无变化;GSHEE和NAC可提高KC中GSH水平(P<0．05),降低NF-κB活性和TNF-α释放(P<0．05)。 NAC与BSO合用时KC中GSH水平无变化,TNF-α释放降低(P<0．05)。结论NAC通过抑制KC中 NF-κB的激活和TMF-α的释放调节KC功能,但这种抑制作用并非通过增加GSH介导。

携带米非司酮可调控β内啡肽基因腺病毒的构建及鉴定

目的构建携带米非司酮（RU486）可调控β内啡肽（β—EP）基因的腺病毒（Ad—RUNEP）。方法构建携带RU486可调控β-EP基因的腺病毒穿梭质粒pDC312-RUNEP，重组得到Ad—RUNEP后进行扩增、纯化和滴度测定，并分别在载体水平和病毒水平进行验证。Ad—RUNEP感染人皮肤癌上皮A431细胞株24h后，将A431细胞株随机分为6个不同浓度RU486组（R0-5组），每组5孔，均加入RU486诱导β—EP表达，终浓度分别为0、10^-10、10^-9、10^-8、10^-7和10^-6mol／L，应用RU486孵育48h后更换为不含RU486的培养液，于开始RU486孵育的第1天、第2天和第4天取培养液，离心后收集上清液，采用ELISA法测定上清液β—EP浓度。结果经酶切鉴定表明RU486调控系统与β—EP均正确插入pDC312-RUNEP；Ad—RUNEP病毒滴度为2．25×10^10pfu／ml。与R0组比较，R1-5组β—EP浓度升高（P〈0．05）；与凡组比较，R1-5组β—EP浓度降低（P〈0．05）；与孵育第1天比较，第2天时p—EP浓度升高（P〈0．05）；与孵育第2天比较，第4天时β—EP浓度降低（P〈0．05）。结论成功构建了Ad—RUNEP，RU486对Ad—RUNEP合成β-EP具有良好的调控作用。

第三代腺病毒载体重组构建的优化

第三代腺病毒载体以其高容量、长时间转基因表达及低毒性和低免疫原性的优点已经广泛应用于基因治疗中，目前这种病毒载体的重组构建已经有许多优化和改进。

重组小鼠神经生长因子前导肽和人β-内啡肽融合基因非增殖型腺病毒的构建和鉴定

目的构建并鉴定携带小鼠神经生长因子前导肽(PN)和人β-内啡肽(β-EP)融合基因非增殖型腺病毒(Ad-NEP).方法取出生2周、雄性昆明小鼠的颌下腺组织,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增得到PN上游部分序列,全基因合成PN下游部分和人β-EP序列并将其与PN上游部分连接成融合基因并测序.采用AdEasyTM System细菌内重组的方法构建携带小鼠PN和人β-EP融合基因非增殖型腺病毒,PCR鉴定后扩增不含野毒的阳性克隆并纯化,采用50%组织培养感染剂量(TCID50)法测定病毒滴度;体外转染人皮肤癌上皮(A431)细胞,3 d后RT-PCR观察融合基因的转录,免疫组化法检测细胞内β-EP的表达,放射免疫法检测感染后1、3、7 d时培养基内β-EP的浓度.结果融合基因序列正确,PCR可检测到475 bp的融合基因条带并排除野病毒株,腺病毒Ad-NEP滴度为1.5×1010pfu/ml.A431细胞转染病毒后3 d RT-PCR可以检测到475 bp大小的融合基因片段,免疫组化染色后细胞内出现橙黄色浓染颗粒,Ad-NEP组感染后1、3、7 d时细胞培养基内人β-EP浓度高于对照组(P＜0.01),感染后3、7 d Ad-NEP组β-EP浓度比感染后1 d高(P＜0.05或0.01).结论成功构建能在体外培养的非神经内分泌细胞内外高效转基因表达人β-EP的重组腺病毒.

供肝保养液中不同浓度肝素对肝移植术患者新肝期凝血功能的影响

目的探讨供肝保养液中不同浓度肝素对肝移植术患者新肝期凝血功能的影响。方法拟行肝移植术的终末期肝病患者40例,随机分为3组,供肝保养液中肝素浓度分别为2 000 U/L(Ⅰ组,n=14)、8 000 U/L(Ⅱ组,n=12)、20 000 U/L(Ⅲ组,n=14)。新肝期前15 min(T0)、新肝期5、30、60、 120、180 min(T1、T2、T3、T4、T5)采中心静脉血,行Sonoclot凝血和血小板功能分析,各组随机测定3-4 例患者血浆肝素浓度(高效液相色谱法)。结果与T0相比,Ⅲ组T1-4时玻璃珠激活凝血时间 (gbACT)均延长,T1-3时血块凝结速率(CR)减慢,T1,2时血小板功能(PF)减小,Ⅱ组T1,2时gbACT延长,T1时CR减慢(P<0．05或0．01),Ⅲ组上述指标的变化较Ⅱ组明显;T1,2时Ⅲ组血浆肝素浓度高于Ⅱ组(P<0．05),Ⅰ组新肝期各时点均未检测到肝素。结论保养液中高浓度肝素可抑制肝移植术患者新肝期凝血功能。

终末期肝病患者罗库溴铵的代谢途径

目的探讨终末期肝病患者罗库溴铵的代谢途径。方法拟行肝移植术的终末期肝病患者20例，年龄21-64岁，体重54～80kg，ASAⅡ级或Ⅲ级。静脉注射异丙酚、芬太尼和罗库溴铵麻醉诱导，气管插管后机械通气。采用四个成串刺激监测肌松程度。麻醉维持：静脉输注异丙酚，吸人N2O，间断静脉注射芬太尼；待L恢复到5％时，颈内静脉输注罗库溴铵，初始输注速率为3μg·kg^-1·min^-1，调节输注速率维持T15％～15％。记录无肝前期、无肝期及新肝期罗库溴铵用量，无肝期与无肝前期罗库溴铵用量的比值与术前Child-Pugh评分进行直线相关分析。结果无肝前期、无肝期、新肝期罗库溴铵用量分别为3．2±1．2、1．7±0．6、（2．1±0．7）μg·kg^-1·min^-1，无肝期和新肝期罗库溴铵用量较无肝前期下降（P〈0．01），新肝期较无肝期罗库溴铵用量增加（P〈0．01）。无肝期罗库溴铵用量为无肝前期的（54±16）％，无肝期与无肝前期罗库溴铵用量的比值与术前Child—Pugh评分成正相关（r=0．54，P〈0．05）。结论终末期肝病患者罗库溴铵更多地依赖肝外代谢。