沉默 Piwil2表达对子宫颈癌细胞增殖和衰老的影响

目的采用shRNA沉默Piwil2基因的表达,探讨其对宫颈癌细胞株增殖和衰老特性的影响。方法通过脂质体Lipofectamine2000转染技术和嘌呤霉素筛选,建立稳转Sh-piwil2宫颈癌细胞株,采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)和Western blot法验证沉默效果。采用细胞增殖实验、集落形成实验、细胞周期和细胞衰老等实验观察沉默Piwil2表达对宫颈癌细胞生物学特性的影响。结果建立稳定转染Sh-piwil2宫颈癌细胞株,与对照组相比,沉默Piwil2表达后细胞的增殖和集落形成能力均显著降低(P<0.05);细胞G0/G1期比例增加、S期比例明显下降(P<0.05),同时沉默Piwil2后细胞衰老数量明显增多(P<0.05)。结论沉默Piwil2基因可发挥抗宫颈癌作用,推测Piwil2基因可作为宫颈癌临床治疗的一个潜在靶点。

丙戊酸钠联合全反式维甲酸诱导三维培养模型中子宫颈癌细胞的分化作用

目的:探讨丙戊酸钠(VPA)联合全反式维甲酸(ATRA)对三维细胞培养模型中宫颈癌细胞的诱导分化作用。方法:将HeLa和SiHa细胞株接种于培养支架,构建宫颈癌细胞三维培养模型。实验分为VPA+ATRA组、VPA+ATRA+LY-294002组和对照组(加等量DMSO)。培养2周后,收获支架,石蜡包埋、切片。采用免疫荧光检测维甲酸受体β2(RARβ2)、E-cadherin及上皮细胞分化指标Filaggrin、Involucrin和Loricrin的表达;利用免疫荧光双标技术检测p-Akt/E-cadherin及p-Akt/Involucrin表达的时空关系,分析PI3K/Akt通路的调控作用。结果:与对照组比较,VPA联合ATRA上调三维培养模型中HeLa和SiHa细胞RARβ2及E-cadherin的表达(P<0.01),进而诱导上皮细胞分化标记Filaggrin、Involucrin和Loricrin的表达(P<0.05),提高Akt磷酸化水平;加LY-294002后,RARβ2和E-cadherin的表达无明显变化,但显著抑制Akt的磷酸化(P<0.01),分化指标的的表达显著降低(P<0.01)。结论:VPA联合ATRA可诱导三维培养模型中宫颈癌细胞的分化;上调RARβ2及E-cadherin的表达,其可能的作用机制是通过PI3K/Akt信号通路发挥作用。

丙戊酸钠联合全反式维甲酸促进子宫颈癌细胞衰老的发生

目的研究丙戊酸钠(VPA)联合全反式维甲酸(ATRA)诱导子宫颈癌细胞衰老作用,并探讨其分子机制。方法实验分为对照组、VPA组、ATRA组、VPA+ATRA组,采用3 mmol/L VPA、1μmol/L ATRA单独或联合作用于人子宫颈癌He La及Si Ha细胞,对照组仅加溶媒;采用Cell Titer96AQueous法检测细胞增殖;β-半乳糖苷酶化学染色法检测细胞衰老;Q-PCR和Western blot法分别检测衰老相关基因P16、P63、h TERT的mRNA和蛋白表达变化。结果 VPA对He La及Si Ha细胞均有生长抑制作用,与ATRA联合抑制效果明显优于单独用药(P<0.05);β-半乳糖苷酶染色显示,VPA+ATRA组衰老细胞比例显著增加,与对照组及VPA组、ATRA组比较,差异有统计学意义(P<0.05);QPCR和Western blot法结果显示,VPA单独和联合ATRA可上调P16、P63的表达,降低h TERT的表达,且联合用药优于单独用药及对照组(P<0.05)。结论 VPA联合ATRA可抑制子宫颈癌细胞增殖,上调P16和P63的表达,下调h TERT的表达,可能是其诱导细胞衰老的分子机制。

HPV18E6真核表达载体的构建及其在HaCaT细胞的表达

目的:构建pEGFP-C2-HPV18E6真核表达载体,观察其在HaCaT细胞中的表达。方法:采用RT-PCR法从HeLa细胞中扩增出带有XhoⅠ、EcoRⅠ酶切位点的HPV18E6基因片段,双酶切技术将HPV18E6基因全长片段克隆到真核表达载体pEGFP-C2上,PCR、双酶切、测序鉴定重组质粒;将重组质粒pEGFP-C2-HPV18E6通过脂质体瞬时转染HaCaT细胞,RT-PCR及融合蛋白绿色荧光观察,检测目的基因的表达。结果:双酶切及测序结果表明真核表达载体pEGFP-C2-HPV18E6构建成功,转染HaCaT细胞48h后可见绿色荧光蛋白的表达,RT-PCR可扩增目的基因条带。结论:成功构建了pEGFP-C2-HPV18E6真核表达载体,为进一步研究HPV18E6的生物学功能提供了帮助。