ADA活性紫外吸收测定法的改良及复感儿淋巴细胞该酶活性的检测

检测了42例健康儿童和17例反复上呼吸道感染患儿（复感儿）的血淋巴细胞腺苷脱氨酶（ADA）活性，结果表明：复感儿的血淋巴细胞中ADA活性较健康儿童低下，且大多同样伴有不同程度的免疫功能低下；从复感儿组中筛选了两侧ADA活性和免疫功能明显低下的患儿，拟采用这两例患儿的血淋巴细胞进行ADA－SCID基因治疗的实验研究。

利用复感儿T淋巴细胞作为外源性ADA基因表达效应细胞的实验探讨

对４１例健康儿童和１７例反复呼吸道感染患儿（复咸儿）的外周血淋巴细胞ＡＤＡ活性进行了检测．两例ＡＤＡ活性明显低下的复感儿的外周血Ｔ淋巴细胞被选作实验样品，经体外培养后，采用ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ介导的的方法导入外源性ＡＤＡ基因．结果表明：体外培养的两例复感儿淋巴细胞中ＡＤＡ活性较基因转移前升高；

Lipofectin介导转移的外源性ADA基因在反复上感儿T淋巴细胞的表达

本文对４１例健康儿童和１７例反复上呼吸道感染患儿外周血淋巴细胞腺苷脱氨酶（ＡＤＡ）活性进行了检测。在此基础上筛选出２例反复上感伴ＡＤＡ活性低下患儿。在体外对这２例患儿的外周血Ｔ淋巴细胞进行培养后，以Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（脂质体）介导的方法对其进行了外源性ＡＤＡ基因的基因转移。结果显示：２例患儿体外培养淋巴细胞ＡＤＡ活性较转基因前升高。同步进行的标志基因ｐＢＬａｃＺ的基因转移的检测结果也直观地证实了Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ介导的基因转移是成功的。该研究为ＡＤＡ－ＳＣＩＤ淋巴细胞基因治疗的研究提供了初步的体外实验资料。

转染人CD80基因的黑色素瘤细胞生长特性及免疫原性探讨

目的：初步探讨弱免疫原性肿瘤细胞导入ＣＤ８０ 基因后免疫源性是否增强，以及肿瘤免疫原性与细胞表面分子的关系。方法：通过脂质体介导将ＣＤ８０ 基因导入小鼠黑色素瘤Ｂ１６ 细胞后，利用ＳＡＢＣ 法检测ＣＤ８０ 的表达；ＭＴＴ 法测定肿瘤细胞体外增殖能力；将肿瘤细胞接种至同源小鼠皮下后观察成瘤期、荷瘤小鼠存活期及肿瘤结节生长速度；在同源淋巴细胞肿瘤细胞混合培养（ ＭＬＴＣｓ） 后，通过测定淋巴细胞增殖指数（ ＭＴＴ 法） 和ＣＴＬ 杀伤活性（ＬＤＨ 释放改良法） 检测肿瘤细胞的免疫原性。结果：ＣＤ８０ 基因转染的Ｂ１６ 细胞中存在ＣＤ８０ 的稳定表达；与野生型Ｂ１６ 细胞和模拟转染的Ｂ１６ 细胞比较，ＣＤ８０ 转染的Ｂ１６ 细胞体外生长速度无明显变化（ Ｐ ＞ ０－０５） ，体内生长速度明显减慢（ Ｐ＜ ０－０５） ，体外刺激淋巴细胞增殖和诱导ＣＴＬｓ 的能力明显增强（ Ｐ＜ ０－０５） 。结论：弱免疫原性肿瘤细胞导入ＣＤ８０ 基因可增强免疫原性，其作用强弱与肿瘤细胞表达ＭＨＣ 及ＩＣＡＭ１ 等分子的状况有关。

pBLacZ真核表达载体的构建及其在体内外的表达

构建了一种编码β－半乳糖苷酶的真核基因表达载体ｐＢＬａｃＺ。用它对体外培养的ＮＩＨ／３Ｔ３、ＣＯＳ－１、ＣＨＯ细胞株、原代培养的小鼠皮肤成纤维细胞，以及小鼠活体皮下和大鼠活体骨骼肌中进行了基因转移。经Ｘ－ｇａｌ组织化学染色后的结果证实：此基因载体可在这些组织细胞中有效地表达产生β－半乳糖苷酶活性。ｐＢＬａｃＺ作为一种新的标志基因载体，可能具有一定的应用价值。

小鼠B7-1cDNA克隆、测序、表达及其抗瘤效应的初步探讨

用反转录ＰＣＲ的方法，从ＢＡＬＢ／ｃ小鼠脾细胞中扩增出Ｂ７－１ｃＤＮＡ后，插入ｐｃＤＮＡ３质粒中构建成小鼠Ｂ７－１ｃＤＮＡ的真核表达载体ｐＣＤ－ｍＢ７．１，经酶切鉴定和序列分析证实此表达载体中插入的Ｂ７－１ｃＤＮＡ的序列与文献报道一致．通过脂质体介导将ｐＣＤ－ｍＢ７．１导入Ｂ７－１的小鼠黑色素瘤细胞系Ｂ１６（Ｆ０）中，经ＲＴ－ＰＣＲ和ＲＮＡ斑点杂交初步证实Ｂ７－１在肿瘤细胞中获得了稳定有效的表达．同源小鼠脾淋巴细胞与肿瘤细胞混合培养后采用ＬＤＨ释放改良法测定淋巴细胞特异杀伤活性，结果显示，与野生型和模拟转染的Ｂ１６细胞相比，Ｂ７－１基因转染的Ｂ１６细胞能较有效诱导淋巴细胞产生针对野生型Ｂ１６细胞的特异杀伤活性（ｐ＜０．０２）．这说明，将Ｂ７－１基因导入肿瘤细胞表达能提高其免疫原性。

p53基因结构和表达的改变与慢性粒细胞性白血病急变的关系

应用PCR- SSCP、Northern blot和免疫细胞化学方法,对30例临床各期慢性粒细胞性白血病(CML)和K562、HL-60细胞系进行p53基因突变与表达的研究。结果发现,17例慢性期CML中仪1例有外显子6的突变和细胞内P53蛋白的聚积,所有病例均可检测到p53的mRNA表达。而4例加速期和9例急变期CML中各有2例分别在外显子5、6、7上发现突变,有p53表达的仅7例,1例加速期患者的P53蛋白呈强阳性。K562和HL-60细胞系中P53蛋白和mRNA均呈阴性。CML恶化进程中p53基因突变和表达频率的改变表明P53基因的改变至少在部分CML急变中起着重要作用。

氯化锂离心纯化质粒DNA方法的建立及其效果评价

本文建立了一种采用氯化锂离心纯化质粒ＤＮＡ的方法。该法不需要特殊的仪器设备和昂贵的试剂材料，操作简便易行。用此法对ｐＵＣ和ｐＧＥＭ等多种系统的质粒进行了提取纯化。结果表明：纯化的质粒ＤＮＡ无ＲＮＡ、蛋白质和染色质ＤＮＡ污染，其得率与氯化铯超离心法相近；酶切效果良好；可直接用于哺乳动物细胞的基因转移并获得有效表达。

ADA-LacZ融合基因直接注射导入小鼠皮肤组织后的表达

将ADA－LacZ融合基因经直接注射导入小鼠皮肤组织，用注射点处的皮肤组织制作冰冻切片，经组织化学方法显示：此融合基因可在皮肤成纤维细胞中表达一种具有腺苷脱氨酶（ADA）和β-半乳糖昔酶（β-gal）双重酶活性的融合蛋白，这种直接将融合基因导入体内进行表达的方式．为在基因治疗和基因疫苗研究中探索一条新的简便可行的外源基因在体内表达的途径，提供了有益的实验依据。

酸性α－1，4葡萄糖苷酶交叉免疫反应物的火箭电泳检测法

酸性α－１，４葡萄糖苷酶交叉免疫反应物的火箭电泳检测法唐玉珠，尤颖健，何善述（同济医科大学生化教研室武汉４３００３０）酸性α－１，４葡萄糖苷酶（Ａｃｉｄα－Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ，ＧＡＡ）是Ｐｏｍｐｅ病的缺陷酶。由于遗传缺陷的基础不同，有些患者其ＧＡ...

人胎盘酸性a-1,4葡萄糖苷酶的纯化研究

本文对GAA的纯化进行了改良，通过CM-SephadexC-50离子交换、酸化沉淀、（NH_4)_2SO_4分段盐析和SephadexG-100亲和层析等步骤，从人胎盘中提纯了GAA，其比活性为698，729nmol（mgPto．h）^（-1），纯化倍数达3319.4倍，获得率为10．58％。IEF证明已达电泳单点纯，PI=4.7。PAGE上呈现两条蛋白带，与酶染位点一致，分子量分别为110kD和76kD。

ADA-LacZ融合基因直接注射导入大鼠骨骼肌后的表达

ＡＤＡ－ＬａｃＺ融合基因经直接注射导入大鼠骨骼肌内，用Ｘ－ｇａｌ和ＡＤＡ组化染色方法检测的结果表明：在大鼠骨骼肌细胞中，可检测到由ｐＦＰ表达的ＡＤＡ和β－ｇａｌ活性。这提示有望探索出一条对某些遗传性疾病、肿瘤及其它多种疾病导入外源基因实施基因治疗的便捷。

腺苷脱氨酶同工酶的醋纤膜电泳及其应用

采用醋酸纤维薄膜电泳分辨人、鼠淋巴细胞与红细胞中的腺苷脱氨酶（ＡＤＡ）同工酶。对已进行人ＡＤＡ基因转移并筛选后的鼠Ｔ淋巴细胞株Ｙａｃ－Ｉ进行分析检测，发现该细胞株出现一条泳动速率与人ＡＤＡ同工酶相同的电泳带，证实外源性人ＡＤＡ基因可导入体外培养的鼠Ｔ淋巴细胞株Ｙａｃ－Ｉ并表达人的ＡＤＡ。

高温、CO及其联合作用对大鼠HSP70mRNA，HSP70合成影响研究

当组织细胞对热或其它刺激反应时，均被诱导增加ＨＳＰｓ合成。本研究将８只雄性大鼠随机分为四组，分别为对照组、高温组、ＣＯ组、高温＋ＣＯ组。在送氧式高温与毒物联合作用装置中染毒１ｈ，在室温下恢复１ｈ后，测定其肛温、ＨｂＣＯ。断头处死，取其肝脏分析ＨＳＰ７０ｍＲＮＡ和ＨＳＰ７０。结果如下：（１）与对照组相比，高温组、高温＋ＣＯ组大鼠肛温均升高３．０℃以上，ＣＯ组及高温＋ＣＯ组大鼠ＨｂＣＯ含量均达３０％以上，这说明受热及染毒后动物的体温及ＨｂＣＯ含量均符合本实验要求。（２）结果显示，对照组仅有少量ＨＳＰ７０ｍＲＮＡ，与之相比，ＣＯ组有所增加，高温组增加明显，而高温＋ＣＯ组增加更为明显，表现为协同作用。ＨＳＰ７０合成也与ＨＳＰ７０ｍＲＮＡ结果一致。

Lipofectin介导转移的外源性ADA基因在小鼠T淋巴细胞中的表达

本文选择小鼠T淋巴细胞系（YAC-I）为基因转移的靶细胞，采用Lipofectin介导的基因转移方法，将载有人腺苷脱氨酶（ADA）基因的真核表达载体和载有Neo^R基因的真核表达载体共转化导入体外培养的YAC-I细胞，然后对转化筛选后的YAC-I细胞进行了ADA的定性定量分析。实验结果表明：经转化筛选的YAC-I细胞中的ADA活性为未转化YAC-I细胞中内源ADA活性的l．6倍，且转化筛选的YAC-I可经电泳分离出两条迁移率不同的人、鼠ADA同工酶带，提示Lipofectin介导转移的外源性人ADA基因在小鼠淋巴细胞中获得了表达，从而为以后开展基因治疗研究提供了一定的实验依据。

ADA同工酶醋纤薄膜电泳法的建立及其在基因转移实验中的应用

本文建立了一种ＡＤＡ同工酶醋纤电泳法，本电泳方法选用醋酸纤维薄膜为电泳支持物，可将人、鼠的红细胞及淋巴细胞中的ＡＤＡ同工酶有效分离开来；以进行了人ＡＤＡ基因转移后的鼠Ｔ淋巴细胞株Ｙａｃ─Ｉ作为检测样品，用本电泳法进行了检测，结果显示：经基因转移并筛选后的细胞较基因转移前的细胞额外出现了一条泳动速率与人ＡＤＡ同工酶相同的电泳带。这表明本法对ＡＤＡ基因转移后的表达产物的分析检测具有应用价值。

体外培养淋巴细胞基因转移的实验探讨

以ＰＨＡ、ＩＬ－２体外诱导培养２～３ｗｋ的淋巴细胞作为受体细胞，在脂质体介导下进行腺苷脱氨酶及β－半乳糖苷酶基因转移。结果表明：外周血淋巴细胞在体外经ＰＨＡ、ＩＬ－２诱导可大量增殖，其中ＣＤ３＋细胞占９０％以上。脂质体介导外源性ＤＮＡ阳性转染率可高达３０％～４０％以上。转移后细胞表达有活性的基因表达产物。提示应用脂质体对体外扩增的淋巴细胞实施基因转移，其方法简便，转移率高。

Construction of Eukaryotic Expression Vector pBlacz and Its Expression Both in Vitro and In Vivo

A novel eukaryotic expression vector pBlacZ was constructed, which was transfected into the cell lines of NIH/3T3, COS-1, CHO and the primary culture of murine dermatic fibroblasts in vitro, and also into the murine subcutaneous layer and skeletal muscles of rats in vivo. It was detected that the gene expression vector could encode the E. Coli β-galactosidase effectively in all these histocytes. The results suggested that pBlacZ, as a novel expression vector, might have certain value of application.