冷诱导RNA结合蛋白的生物学功能研究进展

冷诱导RNA结合蛋白(cold inducible RNA-binding protein,CIRP)是在哺乳动物细胞中发现的首种冷应激或冷休克蛋白,伴随冷应激过程过量表达。研究证明,CIRP无论是在核酸结构上,还是在氨基酸结构上都是高度保守的,具有较高的同源性,其细胞定位和生理功能可能具有组织特异性;CIRP不仅具有介导冷诱导的细胞生长抑制作用,而且可能参与人和动物渗透应激、紫外线照射应激、缺氧应激、生殖、神经发育与调节、胚胎发育、肿瘤发生,以及动物冬眠等多种生理过程。因此,深入开展CIRP的功能性研究和应用性研究具有重要的基础研究价值和临床医学应用前景。

BALB/C鼠睾丸组织中冷诱导RNA结合蛋白的cDNA克隆与序列分析(英文)

冷诱导RNA结合蛋白(Cold inducible RNA-binding protein,CIRP)在多种冷应激细胞(包括重组中国仓鼠卵巢细胞)中被发现.迄今为止,冷应激对活体生物基因表达的影响还未见报道.和细胞相比,生物体具有更加复杂的冷应激调节机制.本研究以冷处理的BALB/C鼠为实验动物,从其睾丸组织中克隆出了CIRP的cDNA.结果表明,CIRP在生物体中能够被低温诱导,可能防止生物体遭受冷损伤.根据克隆的cDNA所推测的氨基酸序列与GenBank上公布的小鼠、大鼠、人类、牛蛙、美西螈、非洲爪蟾胚胎细胞和卵母细胞的CIRP氨基酸序列同源性分别为100%、99.4%、95.5%、67.4%、58.4%、76.9%和79.1%.这表明CIRP在生物进化过程中是高度保守的,可能具有多种生理功能.因此,这一研究将为探索人类和动物冷应激分子机制创立系统试验模型和奠定新的实践基础.

BALB/C鼠冷诱导RNA结合蛋白的原核表达、纯化及其单克隆抗体的制备

为了获得冷诱导RNA结合蛋白(CIRP)的单克隆抗体,通过RT-PCR方法从冷处理BALB/C小鼠睾丸的总RNA中扩增获得CIRP基因序列,克隆至pGEM-T载体,获得重组质粒pGEM-CIRP,并进行序列测定。将测序正确的CIRP序列插入质粒pQE-30-Xa,构建表达载体pQE-30-CIRP并转化E.coliM15,IPTG诱导后SDS-PAGE分析表明CIRP基因在大肠杆菌中获得高效表达,可溶性分析表明CIRP融合蛋白以包涵体形式表达。采用Ni-NTA亲和层析、电洗脱纯化融合蛋白CIRP,将纯化的蛋白免疫BALB/C小鼠,三次免疫后,间接ELISA测定小鼠效价,效价为1:105,采用杂交瘤技术融合,用间接ELISA法、有限稀释法筛选阳性杂交瘤细胞,通过Western blot对McAb特异性进行鉴定,利用间接ELISA方法对McAb的Ig亚类(型)、杂交瘤细胞上清、腹水效价进行测定。结果获得了1A6、2D3、3C5及4C44株稳定分泌CIRPMcAb的杂交瘤细胞株,1A6、3C5、4C4产生的单克隆抗体亚类均为IgG2b,2D3产生的单抗亚类为IgG3,轻链均属κ链。4株单克隆细胞上清效价均在1:103以上,腹水效价均达1:107以上。Westernblot分析4株单抗均能与重组蛋白CIRP特异性结合,与空载体对照没有反应。以3C5细胞株的腹水为一抗,检测冷应激小鼠多种组织中天然CIRP蛋白表达,结果显示3C5细胞腹水能识别心、肝、脾、肺、肾、脑、睾丸等多种组织中天然CIRP,并与能之与结合。这证明该抗体具有良好特异性和结合活性,制备的单克隆抗体可以用于深入开展CIRP的功能性和应用性研究。