藏绵羊BOLL的分子特征及其在睾丸中的表达调控与功能分析

【目的】BOLL作为一个RNA结合蛋白,可通过与其他分子相互作用而在精子发生过程中发挥不可或缺的作用。研究旨在分析藏绵羊BOLL的序列特征及其在睾丸中的表达与分布模式,进而探究其表达调控与潜在的生物学功能,以期为进一步解读BOLL在绵羊精子发生中的作用机制提供必要的思路和分子见解。【方法】选取3月龄(性成熟前)、1岁龄(性成熟)和3岁龄(成年)3个关键发育阶段各8只健康的雄性藏绵羊。以睾丸组织总RNA为模板,采用RT-PCR技术克隆藏绵羊BOLL的完整编码序列(coding sequence,CDS)区;通过相关生物信息学软件对BOLL的序列与结构特征及其互作蛋白进行分析;采用实时荧光定量PCR(quantitative real time PCR,qRT-PCR),Western blot和免疫荧光染色法对BOLL在3个发育阶段睾丸组织中的表达和免疫定位特征进行检测;基于课题组前期有关藏绵羊睾丸组织全转录组测序数据,借助相关数据库进行绵羊BOLL的竞争性内源RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)调控网络和功能注释分析,并采用qRT-PCR和双荧光素酶报告实验对其表达特征及靶向关系进行验证。【结果】藏绵羊BOLL CDS区全长为888 bp,可编码295个氨基酸,含有由81个氨基酸残基组成的RRM结构域(靠近N端)和25个氨基酸残基组成的DAZ重复基序。绵羊BOLL在不同哺乳物种间(特别是山羊、川南山地黄牛和牦牛)具有高度的序列同源性和进化保守性。BOLL蛋白与10个雄性生殖细胞发育相关蛋白质分子间存在潜在的相互作用。随着年龄的增加,在藏绵羊睾丸中BOLL mRNA的表达持续上调,而其蛋白的表达先上调后下调。BOLL蛋白主要存在于性成熟后(1岁龄和3岁龄)睾丸内的精子细胞中,也在精母细胞和整个发育阶段的精原细胞中有少量分布。qRT-PCR结果显示,与3月龄相比,在1岁龄和3岁龄睾丸中微小RNAs(microRNAs,miRNAs)oar-miR-127-5p、oar-miR-382-5p和oar-miR-760-3p的表达量极显著下调(P<0.01),而长链非编码RNAs(long noncoding RNAs,lncRNAs)LOC105602204、LOC105603195和LOC105616228以及环状RNAs(circular RNAs,circRNAs)circ-ECT2L和circ-SPHKAP的表达量极显著上调(P<0.01)。oar-miR-127-5p和oar-miR-760-3p明显降低了BOLL 3′UTR野生型的荧光素酶活性,并且oar-miR-760-3p明显降低了野生型Circ-ECT2L和野生型LOC105616228报告基因的荧光素酶活性。【结论】报道了藏绵羊睾丸中BOLL的分子结构特征、表达规律及潜在的表达调控作用。BOLL主要在藏绵羊减数分裂后的圆形和长形精子细胞中表达,并且其表达受到oar-miR-127-5p和oar-miR-760-3p的直接靶向负调控以及oar-miR-760-3p介导的circRNA Circ-ECT2L和lncRNA LOC105616228的正向调控,进而可能与下游信号分子相互作用,以参与调节绵羊精子细胞向成熟精子分化。

全网数据设备自动备份

网络规模越来越大，设备越来越多。运维人员管理着成百上千台的设备，一方面要保障设备稳定运行，另一方面要快速处理故障，这就需要运维人员平时不断更新备份设备的配置数据。本文重点阐述，如何开发简单的小程序轻松实现自动备份全网数据设备的配置。

绵羊TGF-β1在临床型乳腺炎乳腺组织中的表达

转化生长因子β1受体(transforming growth factor-β 1,TGF-β1)是CD14单核细胞中的生存因子,当TGF-β1缺失时CD14单核细胞迅速执行凋亡程序。然而,目前有关TGF-β1基因在绵羊乳腺炎发生过程中的调控机制尚不清楚。为研究TGF-β1基因在患临床型乳房炎绵羊乳腺组织中的表达差异,本试验使用NCBI网站已公布的绵羊TGF-β1基因CDS序列,运用生物信息学分析方法对该基因生物学特征进行预测。通过qRT-PCR、Western blot检测健康和临床型乳腺炎绵羊乳腺组织中TGF-β1 mRNA及蛋白的表达,并使用免疫组织化学染色确定该蛋白在绵羊乳腺组织内分布情况。生物信息学分析结果表明,绵羊TGF-β1蛋白为疏水性不稳定蛋白,属于分泌蛋白,不同物种间保守性较高。qRT-PCR与蛋白免疫印迹结果显示,在健康和临床型乳腺炎乳腺组织中均存在TGF-β1基因的表达,且TGF-β1 mRNA与蛋白相对表达量均极显著(P<0.01)高于健康组。免疫组织化学结果显示,TGF-β1蛋白在临床型乳腺炎乳腺组织中均强烈表达于基质细胞和乳腺上皮细胞。由此推测可能是由于TGF-β1基因表达上调,导致患临床型乳腺炎乳腺组织中基质细胞与乳腺上皮细胞中炎症反应加剧。这为进一步研究TGF-β1基因在绵羊乳腺炎发病机制中的调控作用提供基础信息。

绵羊CD14基因在临床型乳腺炎乳腺组织中的表达

白细胞分化抗原14(cluster of differentiation antigen 14,CD14)是由成熟的单核巨噬细胞分泌的多态类炎症细胞因子,在细胞激活、免疫反应调节和机体炎症反应过程中起到关键作用。到目前为止,关于CD14基因在绵羊乳腺炎乳腺组织发生过程的研究仍处于空白阶段。为分析CD14基因的序列以及在临床型乳腺炎乳腺组织中的表达特征,本研究基于NCBI网站已公布的绵羊CD14 CDS序列,对该基因生物信息学进行分析。使用qRT-PCR、Western blot与免疫组织化学染色的方法检测CD14 mRNA及其蛋白在健康和临床型乳腺炎绵羊乳腺组织中的表达与分布情况。生物信息学分析结果显示绵羊CD14为疏水性不稳定蛋白、分泌蛋白,在进化过程中CD14基因高度保守趋于稳定。qRT-PCR与Western blot结果显示,临床型乳腺炎乳腺组织中CD14 mRNA显著高于健康组(P<0.05),CD14蛋白的相对表达量极显著高于健康组(P<0.01)。免疫组织化学检测结果显示在健康绵羊乳腺组织细胞中的CD14蛋白主要存在于基质细胞中,而在临床型乳腺炎乳腺组织中于乳腺上皮细胞和基质细胞中均强烈分布。这可能是由于CD14基因表达的上调,导致患临床型乳腺炎乳腺组织中基质细胞与乳腺上皮细胞中炎症反应加剧。为进一步研究CD14基因在绵羊乳腺炎发病机制中的调控作用提供了基础信息。

湖羊CASP3基因的序列分析及其在临床型乳腺炎乳腺组织中的表达特征

半胱氨酸蛋白酶3(caspase 3,CASP3)是半胱氨酸蛋白酶家族(caspase,CASP)中的重要成员,处于细胞凋亡有序级联反应下游,是多种凋亡刺激信号传递的汇聚点,其活化也成为凋亡进入不可逆阶段的标志。然而,目前有关CASP3基因在绵羊乳腺炎发生过程中的调控机制尚不清楚。因此,本试验以湖羊作为试验动物,基于课题组前期转录组测序获得的湖羊CASP3基因CDS序列,采用生物信息学方法对其编码蛋白的理化性质、结构以及不同物种之间的同源性等进行了分析,并利用RT-qPCR、Western blot和免疫组织化学染色方法检测了CASP3基因在健康和患临床型乳腺炎湖羊乳腺组织中的表达与定位特征差异。生物信息学分析显示湖羊CASP3蛋白为亲水性稳定蛋白,其蛋白结构无跨膜区,属于非分泌蛋白,在进化过程中具有高度保守性。RT-qPCR与蛋白免疫印迹结果显示,在健康和临床型乳腺炎乳腺组织中均存在CASP3基因的表达,且临床型乳腺炎乳腺组织中CASP3 mRNA和蛋白的相对表达量极显著(P<0.01),高于健康组。免疫组织化学结果显示CASP3蛋白在健康乳腺组织中主要分布于乳腺上皮细胞中,而在临床型乳腺炎乳腺组织中主要分布于基质细胞和乳腺上皮细胞。提示CASP3 mRNA和蛋白在临床型湖羊乳腺组织中表达均上调,这为进一步研究CASP3基因在绵羊乳腺炎发病机制中的调控作用提供基础信息。