蓝舌病病毒荧光定量RT-PCR检测技术

蓝舌病是一种侵害反刍动物的虫媒传染病,被世界动物卫生组织(Office International des Epizooties,OIE)列为上报疾病,我国将其列为一类动物疫病。本研究利用计算机软件分析获取蓝舌病病毒(Bluetongue virus,BTV)核酸检测的保守靶序列,设计引物和TaqMan荧光探针,建立了BTV荧光定量RT-PCR技术,进行了特异性、敏感性、重复性等实验评价,并对动物样品进行检验。结果显示,该技术可有效检出不同血清型BTV,与流行性出血病病毒(Epizootic hemorrhagic disease virus,EHDV)无交叉反应;对RNA标准品的检测灵敏度为102copies;重复检测CV<5%,可对动物样品进行有效检测。因此,所建立的BTV TaqMan/荧光定量RT-PCR技术可为蓝舌病诊断提供一种快速、可靠的病原检测手段。

抗五步蛇毒ScFv噬菌体显示文库的构建及表达

目的 :构建抗五步蛇毒的特异性ScFv噬菌体显示文库 ,并从中筛选出阳性克隆。方法 :用五步蛇毒素免疫BALB C小鼠 ,挑选其中效价最高的 3只小鼠提取脾脏组织 ,抽提细胞总RNA ,经RT PCR分别扩增出VH、VL基因片段 ,经Linker连接成ScFv基因 (singlechainvariablefragment) ,再把ScFv基因重组到pCANTAB 5E载体 ,转化至大肠杆菌TG1中表达 ,经辅助噬菌体 (Helperphage)M13K0 7拯救后建成噬菌体显示文库。结果 :经 4轮吸附 洗脱 富集筛选后 ,库容量达到 4× 10 8cfu L ,随机挑取 90个克隆进行ELISA检测 ,结果 16个呈阳性 ,并进行了重复验证。结论

甲型H1N1流感病毒核酸荧光定量RT-PCR检测技术

目的:建立基于TaqMan荧光探针技术的甲型H1N1流感病毒实时定量RT-PCR方法。方法:分析H1N1流感病毒基因特性,根据新发甲型H1N1流感病毒突变基因片段设计检测引物和TaqMan荧光探针,建立荧光定量RT-PCR检测体系,体外转录制备RNA标准品,进行特异性、敏感性、重复性及盲样检测评价实验。结果:可特异性有效检测新发甲型H1N1流感病毒核酸,与H1～H16流感病毒基因无交叉反应;对RNA标准品的检测敏感性达103拷贝/μL;重复性实验中,阳性标准品Ct值变异系数(CV)<10%,阴性标准品检测结果均呈阴性;12份盲样检测结果特异性好。结论:该荧光定量RT-PCR方法可作为甲型H1N1流感防控的病原快速诊断技术。

蓝舌病毒群特异性RT-PCR检测技术及其应用

目的:建立一种适于蓝舌病毒(BTV)群特异性基因检测的RT-PCR方法。方法:根据本实验室设计的一对BTVNS1基因通用型检测引物建立BTV群特异性RT-PCR检测技术;对不同血清型BTV及鹿流行性出血热病毒(EHDV)进行检测,验证其特异性;同时,利用该方法检测血清模拟样品及抗病毒血清样品。结果:所设计的检测方法特异性好,与EHDV无交叉反应,可检测至少17个血清型BTV,并能有效检出不同病毒浓度的模拟样品及不同型的血清样品。结论:建立的RT-PCR方法可用于BTV群的特异性通用检测。

单链抗体的研究进展

抗体在疾病的诊断、治疗和预防中发挥着重要的作用,其生产制备经历了抗血清多克隆抗体和单克隆抗体(Monoclonalantibodies,McAb)阶段,现已进入了基因工程抗体的时代。基因工程抗体主要包括单链抗体(ScFv)、Fab抗体、F(ab`)2抗体等小分子抗体、嵌合抗体和改形抗体。本文就单链抗体的研究进展作了综述。

生物条形码检测技术与超微量病毒抗原蛋白检测

基于纳米材料的生物条形码检测技术,以其超灵敏度检测特性大大推动了超微量蛋白免疫学检测技术的发展,并在痕量病毒抗原蛋白超灵敏检测研究中得到较好的应用。本文主要介绍传统生物条形码检测技术和新型生物条形码检测技术,并阐述该技术在人免疫缺陷病毒(HIV)、蓝舌病病毒(BTV)和其他病原标志蛋白中的应用情况。

蓝舌病毒核酸检测技术研究进展

蓝舌病毒(BTV)血清型较多,其核酸检测主要涉及通用型检测和分型检测,寻求相应的适宜检测靶基因尤为重要。BTV核酸检测技术是蓝舌病诊断的重要手段,其发展过程主要经历了基因杂交探针技术、RT-PCR检测技术、实时荧光定量PCR检测技术及基因芯片检测技术等;同时,建立和完善高通量BTV筛查技术成为迫切要求。

犬“猝死症”病原的分离鉴定

为了找到犬“猝死症”的病原体 ,给该病的有效防治提供依据。对病例进行剖检后 ,采集病料做胃肠毒素、细菌、病毒以及生化检验。

猪源胰酶中特异病毒和非特异病毒安全检测

目的:对猪源胰酶样品进行病毒检测,以评价其病毒安全性。方法:非特异性病毒检测采用致细胞病变、血凝吸附试验和形态学检测方法;特异性病毒检测包括猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒(PCV)、猪细小病毒(PPV)、猪口蹄疫病毒(FMDV)和猪伪狂犬病病毒(PRV)特异性核酸检测,以及CSFV、PPV、PRV特定性抗原蛋白直接免疫荧光检测。结果:受检样品非特异性病毒检测中,未见可观察到的细胞病变产生和病毒粒子,对豚鼠、鸡和人的O型红细胞无凝集现象。特异性病毒检测中,PRRSV、CSFV、PCV、PPV、FMDV和PRV核酸检测均为阴性,CSFV、PPV、PRV免疫荧光检测均为阴性。结论:猪源胰酶样品经非特异性病毒检测和特异性病毒检测均无可检出的病毒存在。

犬细小病毒VP2基因的比较及分型研究

为查明我国CPV的流行变异情况及为进一步的免疫研究奠定基础,对我国不同地区分离到的9株细小病毒毒株进行了VP2基因的扩增和序列分析,并与CPV的参考毒株进行了比较分型, 9 株CPV 中有6 株属CPV 2a,3株属CPV 2b,但未分离到CPV 2c变异株,结果表明我国目前仍以CPV 2a流行为主。

纤维蛋白止血敷料的生物相容性研究

目的评价纤维蛋白止血敷料的生物相容性。方法对纤维蛋白止血敷料进行如下生物学检测:细胞毒性试验(MTT法)、急性全身毒性试验、皮肤刺激试验、皮内刺激试验和溶血试验,根据标准对实验数据进行分析和评估。结果纤维蛋白止血敷料的细胞毒性分级0—1级;无急性全身毒性作用,无皮肤刺激反应、皮内刺激反应,无溶血性。结论纤维蛋白止血敷料具有良好的生物相容性。

纤维蛋白止血敷料的止血效果

目的评价纤维蛋白止血敷料对股动脉切口和肝脏损伤出血模型的止血效果。方法制造大鼠股动脉切口出血模型和兔肝脏损伤出血模型,分别用纤维蛋白止血敷料和医用胶原蛋白海绵进行止血,记录止血时间和出血量。结果对大鼠股动脉切口模型,纤维蛋白止血敷料止血时间为(90.60±33.12)s,出血量为(0.51±0.26)ml,医用胶原蛋白海绵止血时间为(164.20±53.70)s,出血量为(1.04±0.50)ml,二者差异有统计学意义(P<0.05);对兔肝损伤模型,纤维蛋白止血敷料止血时间为(48.67±8.14)s,出血量为(0.82±0.09)ml,医用胶原蛋白海绵止血时间为(107.67±6.66)s,出血量为(1.07±0.13)ml,二者差异有统计学意义(P<0.01)。结论纤维蛋白止血敷料的止血效果优于医用胶原蛋白海绵,是一种良好的止血材料。

牛病毒性腹泻病毒E0基因重组慢病毒载体构建和鉴定

为构建携带牛病毒性腹泻病毒(BVDV)E0基因的重组慢病毒质粒,并检测其在HEK-293T细胞中的表达,本研究通过合成BVDV E0基因序列(AJ133739.1),构建包含Ig K信号肽的p ZJ-CMV-e GFP-Ig K-E0重组质粒和不含信号肽的p ZJ-CMV-e GFP-E0重组质粒,将其采用PEI方法分别转染HEK-293T细胞包装慢病毒,并浓缩后测定滴度,收集转染后上清液进行western blot检测蛋白表达。通过酶切、PCR及测序鉴定表明E0基因正确整合至慢病毒载体中,western blot结果表明其能够在HEK-293T细胞中表达。本研究构建获得携带BVDV E0基因的重组慢病毒,为BVDV E0蛋白哺乳动物细胞中的表达及其免疫原性研究奠定基础。

蓝舌病病毒VP7蛋白的B细胞表位预测

根据前期试验中测得的蓝舌病病毒VP7蛋白的基因序列和推导的氨基酸序列，利用DNAStar软件和Biosun软件进行生物信息学预测，以单参数（亲水性、可及性、柔韧性、抗原性）预测为基础，结合二级结构预测来综合分析蓝舌病病毒VP7蛋白的B细胞表位。比较两种软件的预测结果发现，在蓝舌病病毒VP7蛋白的381个氨基酸序列中，第81～85、198～202、235～239、253～257区域有较好的亲水性、表面可及性和较高的抗原指数，并且在二级结构上含有易形成抗原袁位的转角和无规则卷曲，最有可能为蓝舌病病毒VP7蛋白的B细胞线性优势表位。上述预测和判定结果表明，在蓝舌病病毒VP7蛋白序列中存在优势B细胞线型表位，为进一步合成多肽并分析已获得的VP7蛋白单抗的结合表位奠定了基础。

蓝舌病毒血清5型毒株S7基因编码区的分子克隆与序列分析

目的:对蓝舌病毒(BTV)血清5型毒株(BTV-5)的S7基因编码区(ORF)进行克隆和序列分析。方法:用TRIzol LS试剂提取病毒总RNA,经反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增BTV-5型毒株S7基因的编码区,将扩增片段克隆到pGEM-T Easy载体上,对阳性克隆进行核苷酸序列测定;采用DNAStar和DNASIS v2.5软件对环状病毒属不同种群的S7基因ORF序列及其推导的氨基酸序列进行同源性及系统进化树分析。结果:克隆的基因片段长1050bp,为S7基因开放性读码框的全长序列,编码349个氨基酸残基;与环状病毒属不同血清型毒株比较,核酸序列同源性范围为42.2%～96.6%,推导的氨基酸序列同源性范围为40.4%～99.7%。结论:蓝舌病毒与非洲马瘟病毒、鹿流行性出血热病毒分属于不同种群,群内不同血清型的S7基因ORF序列及其推导的氨基酸序列显示出很高的同源性,而不同种群之间的同源性很低。

3株钩端螺旋体外膜蛋白基因的序列分析

目的 探讨钩端螺旋体外膜蛋白基因在钩体遗传分类中的作用。方法 对我国的 2株问号钩体赖型 5 6 6 0 1株和爪哇型 5 6 6 0 2株的外膜蛋白基因Ompl1进行PCR扩增 ,得到外膜蛋白基因并进行了全基因序列分析。测序的 2株钩体与流感伤寒型RH5 2株进行了核苷酸序列比较和推导的氨基酸序列比较。结果 赖型 5 6 6 0 1株和爪哇型 5 6 6 0 2株钩体Ompl1基因核苷酸序列与流感伤寒型RH5 2株的同源性分别为 89%和 80 % ,推导的外膜蛋白氨基酸序列的同源性分别为 92 %和88%。由此可以看出 5 6 6 0 1株、5 6 6 0 2株与RH5 2株分别属于不同的血清群 ,这与Yasuda的遗传分类相一致。结论 我国的赖型 5 6 6 0 1株和爪哇型 5 6 6 0 2株及流感伤寒型RH5 2株Ompl1基因的核苷酸序列存在一定差别 。