中间球海胆丙酮酸激酶(PK)基因克隆及其对海水酸化的响应

为明确中间球海胆Strongylocentrotus intermedius丙酮酸激酶(Pyruvate kinase,PK)基因(SiPK)的序列特征、组织表达规律及其对海水酸化胁迫的响应方式,采用cDNA末端快速扩增RACE技术方法获得了SiPK的cDNA全长序列,同时探究了该基因在不同海水酸化[自然海水(对照组)、ΔpH=-0.3(SA1)、ΔpH=-0.4(SA2)、ΔpH=-0.5(SA3),ΔpH表示与自然海水pH的差值]胁迫条件下的响应方式。结果表明:中间球海胆PK序列全长为3616 bp,其中,包含一个编码537个氨基酸的开放阅读框(1614 bp)和两个非编码区片段(5′非编码区长度为91 bp,3′非编码区长度为1911 bp);系统进化分析发现,中间球海胆PK氨基酸序列与紫球海胆Strongylocentrotus purpuratus PK的亲缘关系最近;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)发现,成体中间球海胆PK基因在4种组织中均有表达,其相对表达量依次为性腺>管足>体腔液>肠;总PK酶活性检测显示,中间球海胆4种组织中的总PK酶活性依次为管足>性腺>体腔液>肠;海水酸化胁迫试验显示,与对照组相比,随着海水酸化程度的加重,中间球海胆肠组织中PK基因的相对表达量呈先极显著降低后极显著升高的趋势(P<0.01),但肠组织中总PK酶活性则呈极显著升高的趋势(P<0.01),性腺组织中PK基因的相对表达量随海水pH的降低而极显著降低(P<0.01),但该组织中总PK酶活性却呈现先升高后降低的趋势(P<0.05),管足和体腔液组织中PK基因的相对表达量和总PK酶活性均随海水pH的降低总体呈降低的趋势(P<0.05)。研究表明,中间球海胆可通过调节PK基因的表达及总PK酶活性响应海水酸化胁迫。

棘皮动物线粒体基因组研究进展

线粒体基因组是存在于真核生物线粒体中的重要遗传物质,可独立进行复制、转录和蛋白质合成。与核基因组相比,线粒体基因组具有长度相对较短、点突变率高等特点,被认为是研究生物系统进化的重要对象之一。近年来,在海洋生物研究中,线粒体基因组已被广泛应用于遗传分析、种质鉴定、分子标记挖掘以及系统进化研究等领域并取得了丰富的成果。棘皮动物在全球海洋中分布广泛,属无脊椎动物的高等类群,也是无脊椎动物向脊椎动物进化的重要节点生物。目前已有97个物种完成了线粒体基因组的测序。棘皮动物的线粒体基因组包含37个基因,其中ND6基因均分布于轻链。海胆和海星的基因排列顺序最为保守。棘皮动物在绝大多数情况下会使用ATG作为起始密码子,使用TAA和TAG作为终止密码子。根据现有的线粒体基因组数据和分析方法可以阐明绝大多数棘皮动物的分类与系统进化关系,但仍有一些物种的分析结果缺乏足够的可信度。棘皮动物线粒体基因组研究尚有很多方面仍需进一步开展。

海胆和海参中microRNAs的研究进展

MicroRNAs(MiRNAs)是一种长度为20 nt左右的内源调控型非编码RNA,主要参与基因的转录后调控,在真核生物的生长发育、细胞分化和免疫防御等过程中发挥重要作用。海胆和海参属棘皮类动物,是高等的海洋无脊椎动物,它们不仅是研究无脊椎动物向脊椎动物进化的重要模式生物,其中的一些种类还是重要的渔业资源,具有较高的经济价值。近年来,探明各类miRNAs在海胆和海参生长发育及生理代谢过程中的调控功能及调控机制已逐渐成为海胆和海参研究领域的热点。本研究中综述了近年来海胆和海参中miRNAs的研究成果和相关进展,以期进一步丰富和完善海胆和海参中miRNAs的基础资料,为系统了解和掌握海胆和海参中miRNAs的序列特点、生物学功能及其参与调控重要生理过程的分子机制提供参考资料。

刺参精子冷冻保存方法研究

为获得适宜的刺参Apostichopus japonicus精子冷冻保存技术,综合借鉴现有水产动物精子冷冻保存方法,对刺参精子降温方式、冷冻保存液、精子与冷冻保存液混合比例及复苏温度进行了筛选,在筛选出适宜的刺参精子降温方式基础上,分别以煮沸消毒海水和超纯水为溶剂,加入葡萄糖、NaCl、KCl、海藻糖、无水CaCl2和冷冻保存剂[二甲基亚砜(DMSO)、甘油(Gly)或1,2-丙二醇(1,2-G)]配制冷冻保存剂终体积分数为5%、10%和15%的冷冻保存液(Aj-1~Aj-27),以体积比为1∶1、1∶2和1∶3的比例混合精子与冷冻保存液进行冷冻保存,冷冻48 h后分别在37℃和30℃水浴条件下进行精子复苏,以精子活率、快速运动时间和精子寿命为指标,综合筛选冷冻保存刺参精子的适宜冷冻保存液、精子与冷冻保存液混合比例及复苏温度。结果表明:将刺参精子与以超纯水为溶剂配制的Aj-20精子冷冻保存液(12 g/L葡萄糖、7 g/L NaCl、0.7 g/L KCl、5 g/L海藻糖、0.1 g/L无水CaCl2和终体积分数为10%的DMSO)以体积比为1∶2的比例混合,以三步法降温方式冷冻保存,并在30℃水浴短时迅速复苏,该技术方法为本研究筛选到的最优刺参精子冷冻保存方法;与本研究中其他冷冻技术方法相比,应用该优选方法冷冻保存的刺参精子在复苏后精子活率最大(19.00±4.00)%、快速运动时间最长(1178.67 s±14.57 s)、寿命最久(2817.33 s±93.76 s);应用该优选方法冷冻保存72、120、408 h的精子复苏后受精率可达70%以上(精子与卵子数量比为1×106∶1),受精的卵囊孵化率可达到50%。研究表明,本研究中筛选获得的冷冻保存液配方及其冷冻保存方法比较适宜刺参精子的长期冷冻保存,具有应用于生产实践的潜力。

光棘球海胆TGFBR2基因的克隆及其对海水酸化的响应

为了探究光棘球海胆(Mesocentrotus nudus)转化生长因子-βⅡ型受体(Transforming growth factor-βreceptor typeⅡ,TGFBR2)基因的序列信息及其响应海水酸化的模式和规律。本研究利用同源克隆和cDNA末端快速扩增技术(RACE)首次获得光棘球海胆TGFBR2基因(MnTGFBR2)的cDNA全长序列。结果显示:该基因全长为2260 bp,其中5’非编码区长度为227 bp,3’非编码区长度为254 bp,开放阅读框长度为1776 bp,编码一个含592个氨基酸的多肽。MnTGFBR2蛋白理论分子量为66.11 kD,理论等电点为5.30。同源性及系统进化分析显示,Mn TGFBR2蛋白与紫球海胆(Strongylocentrotus purpuratus)TGFBR2蛋白聚为最近的一支,二者序列一致性高达95.97%。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)结果显示,MnTGFBR2在管足、围口膜、体腔液、肠和性腺5种组织中均有表达,其相对表达量从高到低依次为:管足>围口膜>体腔液>肠>性腺。海水酸化处理实验发现,随着酸化时间的延长,与自然海水组相比,当海水pH值下降0.3个单位时,光棘球海胆性腺组织和肠组织中MnTGFBR2的相对表达均呈先极显著降低(p<0.01)后升高的趋势;当海水pH值下降0.4个单位时,光棘球海胆性腺组织中MnTGFBR2的相对表达呈先极显著降低(p<0.01)后升高再降低的趋势,而肠组织中MnTGFBR2的相对表达则一直呈现极显著降低趋势(p<0.01);当海水pH值下降0.5个单位时,光棘球海胆性腺组织中MnTGFBR2的相对表达呈先极显著降低(p<0.01)再升高的趋势,而肠组织中MnTGFBR2的相对表达则呈显著降低(p<0.05)的趋势。

水产动物“miRNA-靶基因”模体(motif)生物功能研究进展

微小RNA(microRNAs,miRNAs)是一类内源性的、长度在19~25个核苷酸的单链非编码小RNA分子,在生物体内主要参与基因转录后水平的表达调控。研究证实,同一miRNA可以靶向多种不同的基因,同一基因也可以由多个miRNAs调控,miRNA与其靶基因形成的互作模体(motifs)不仅可以调控生物的生长发育,在生殖、代谢和疾病发生等多个方面也具有重要的作用。本研究从miRNA靶基因的鉴定,miRNA调控靶基因的方式以及水产动物中“miRNA-靶基因”模体的研究进展3个方面进行综述,旨在为系统掌握水产动物miRNA对其靶基因的调控特点及规律,探讨水产动物中“miRNA-靶基因”模体参与水产动物重要生理生化过程的分子机制提供更多参考。