FOXO4过表达慢病毒载体构建及顺铂耐药稳定细胞株的建立

目的构建稳定过表达叉头框基因O4(FOXO4)的顺铂耐药细胞株MDA-MB-231/DDP,探讨FOXO4在三阴性乳腺癌(TNBC)细胞顺铂耐药中的作用,为改善TNBC顺铂耐药提供理论基础。方法通过药物剂量递增法诱导乳腺癌细胞MDA-MB-231获得顺铂耐药性,CCK-8法确定细胞的耐药指数。将目的基因FOXO4定向插入载体质粒GV492中构建重组慢病毒表达载体LV-FOXO4-OERNA。通过预实验选取助感液类型、确定感染的最佳转染复数值(MOI)以及嘌呤霉素筛选的最佳浓度。将重组慢病毒表达载体感染MDA-MB-231/DDP细胞,嘌呤霉素最佳浓度筛选FOXO4过表达细胞株(FOXO4-OERNA组)。qRT-PCR和Western blotting检测目的基因表达情况,测定不同组IC 50确定细胞对顺铂敏感性。结果成功建立乳腺癌顺铂耐药细胞株(耐药指数=5.231)。与亲本细胞株相比,MDA-MB-231/DDP耐药细胞株FOXO4 mRNA表达水平显著降低(P<0.05)。通过基因测序证明,序列与预计序列一致,重组慢病毒表达载体构建成功,通过嘌呤霉素成功筛选出FOXO4稳定表达株。通过过表达FOXO4可以降低MDA-MB-231细胞对顺铂的耐药性,FOXO4-OERNA组耐药指数(RI=3.063),逆转指数达到1.708。结论通过药物剂量递增法可建立MDA-MB-231顺铂耐药细胞株,过表达FOXO4可逆转MDA-MB-231/DDP细胞对顺铂的耐药性。

转化生长因子β1影响三阴性乳腺癌顺铂耐药的机制研究

目的:建立三阴性乳腺癌MDA-MB-231/顺铂(DDP)耐药细胞株,探讨转化生长因子β1(TGF-β1)调控三阴性乳腺癌DDP耐药的机制。方法:采用小剂量间歇诱导法建立MDA-MB-231耐药细胞株(MDA-MB-231/DDP),在MDA-MB-231/DDP中构建TGF-β1沉默细胞并分为TGF-β1沉默组(sh-TGF-β1)、阴性对照组以及对照组,实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测TGF-β1含量。另取MDA-MB-231细胞和MDA-MB-231/DDP细胞分为MDA-MB-231组(正常培养MDA-MB-231敏感细胞)、MDA-MB-231-DDP组(正常培养MDA-MB-231 DDP耐药细胞)、TGFβ1-shRNA组(MDA-MB-231 DDP细胞转染TGFβ1-shRNA慢病毒载体)和MDA-MB-231-DDP+3-MA组(MDA-MB-231 DDP细胞给予5mM 3-MA处理2 h)。细胞计数试剂盒(CCK-8)法检测耐药株的半数抑制浓度(IC50),并计算耐药指数及逆转耐药指数,RT-qPCR检测TGF-β1含量,蛋白印迹法(Western blot)检测TGF-β1、自噬相关蛋白LC3-I、LC3-II表达量,激光共聚焦显微镜观察自噬流的变化,应用SPSS 20.0软件进行统计分析。结果:成功建立DDP耐药细胞株MDA-MB-231/DDP,耐药指数为5.231;MDA-MB-231/DDP细胞的TGF-β1 m RNA表达和蛋白表达较MDA-MB-231细胞显著上调(P<0.05)。DDP耐药细胞MDA-MB-231/DDP中自噬相关蛋白LC3-II/LC3-I表达较MDA-MB-231细胞显著升高(P<0.05);应用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)后MDA-MB-231/DDP细胞自噬相关蛋白LC3-II/LC3-I表达显著下降(P<0.05);沉默MDA-MB-231/DDP细胞的TGF-β1基因后,DDP耐药细胞株的耐药指数从5.231下降到3.404,同时自噬相关蛋白LC3-II/LC3-I表达降低(P<0.05),且激光共聚焦显微镜观察到黄色和红色斑点的显著减少,表明自噬受到抑制。结论:TGF-β1与三阴性乳腺癌DDP耐药有关,其机制可能是增加自噬引起MDA-MB-231细胞DDP耐药。通过沉默TGF-β1可降低自噬水平,恢复三阴性乳腺癌细胞对DDP的敏感性。