慢性炎性痛模型小鼠腹外侧眶额叶皮质的转录组分析

目的:筛选小鼠腹外侧眶额皮质(vlOFC)参与疼痛调节的生物学标记物。方法:雄性C57BL/6J小鼠于左后足底注射完全弗氏佐剂(CFA)诱导慢性炎性痛。通过测定缩足阈值(PWT)和缩足潜伏期(PWL)检测痛敏变化。行为学测试之后取小鼠vlOFC新鲜组织进行转录组测序。运用生物信息学方法筛选差异表达基因(DEGs),并进行生物学功能和通路富集分析。结果:与PBS组小鼠相比,CFA组小鼠左后足机械痛阈值和热痛导致的缩爪潜伏期均显著降低(P<0.001)。两组小鼠vlOFC的DEGs为497个,其中上调143个,下调354个。基因本体(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGGs)分析显示:慢性炎性痛模型小鼠,vlOFC的DEGs主要表现在有机阳离子转运、神经递质转运、胞质钙离子浓度的调节等生物过程;与G蛋白偶联受体(GPCRs)、神经肽相关以及铵转运等分子功能相关;DEGs主要集中于神经活性配体-受体相互作用、细胞因子-细胞因子受体相互作用、cAMP信号通路。Reactome功能富集分析显示,参与富集的DEGs数量最多且校正后P值最低的通路为GPCRs配体结合。结论:vlOFC中的离子转运、神经递质转运与结合、GPCRs相关活动参与了慢性炎性痛的调节。

神经干细胞外泌体对低氧所致神经元凋亡的抑制作用

目的:初步探讨神经干细胞分泌的外泌体是否能抑制氯化钴(cobalt chloride,CoCl_2)诱导的缺氧模型中神经元的凋亡,并促进神经元的存活。方法:超速离心法分离大鼠神经干细胞分泌的外泌体;Western blot检测外泌体表面标志物ALG-2相互作用蛋白X(ALG-2-interacting protein X,Alix)和肿瘤易感基因101(tumor susceptibility gene 101,TSG101)的表达水平;用透射电子显微镜观察外泌体的形态;q Nano纳米生物颗粒分析仪检测外泌体的粒径分布。采用不同剂量的Co Cl_2处理神经元,建立CoCl_2诱导神经元凋亡的模型;将神经干细胞分泌的外泌体加入凋亡组神经元,CCK-8法检测细胞活力,TUNEL法检测细胞凋亡。结果:神经干细胞分泌的外泌体可表达Alix和TSG101;外泌体在透射电镜下的形态呈"杯口"状,大小约为100 nm;q Nano纳米生物颗粒分析仪检测外泌体的粒径为(95.0±23.5)nm(n=370);CCK-8实验结果显示不同浓度(200、400和600μmol/L)CoCl_2作用24 h,神经元活力呈剂量依赖性下降(P<0.05);将神经干细胞分泌的外泌体加入凋亡组(CoCl_2浓度为400μmol/L)神经元后,神经元活力升高(P<0.05),凋亡率下降(P<0.05)。结论:神经干细胞分泌的外泌体能抑制低氧状态下神经元的凋亡并促进存活。

心肺复苏后吸入七氟醚通过调控Bcl—2／Bax减少神经元凋亡

目的 观察大鼠心肺复苏（CPR）自主循环恢复（ROSC）后吸入七氟醚对大脑皮层神经细胞凋亡的影响。方法 建立大鼠室颤后CPR模型（VF/CPR）。30只Wistar大鼠随机分为假手术组（Sham group）6只，七氟醚组（Sevo group）12只，对照组（Control group）12只。Sham组仅麻醉及气管插管，Sevo组在ROSC后立即吸入2.4%七氟醚10 min，Control组常规心肺复苏。ROSC 24 h后采用神经缺损评分（Neuro-Deficit Scoring, NDS）量表对大鼠神经功能进行评分；电镜观察线粒体损伤程度和TUNEL法对大脑皮层神经元细胞凋亡进行检测； Western blot检测Bcl-2、Bax和细胞色素C的蛋白表达水平，免疫组化检测活化的半胱氨酸蛋白酶（Cleaved-Caspase 3）的蛋白表达水平。结果 实验前三组动物体质量、心率、平均动脉压差异无统计学意义，复苏中的CPR时间、除颤次数、肾上腺素使用剂量差异无统计学意义。ROSC 24 h后，Sevo组的NDS评分明显高于Control组。电镜下，Sevo组线粒体结构损害程度较轻；TUNEL法显示，凋亡细胞比例明显低于Control组［（12±6）% vs.（22±8）%，P＜0.01］。其次，Sevo组Bcl-2/Bax蛋白比值明显高于Control组［（54±11）% vs.（28±9）%，P＜0.01］，并可抑制细胞色素C的释放，减少Cleaved-Caspase 3的激活。结论 ROSC后吸入七氟醚，可减轻大脑皮层神经元凋亡，改善复苏后脑功能，其机制可能与调节Bcl-2/Bax表达有关。

亚低温上调Sirt1减少氧糖剥夺后原代神经元细胞凋亡

为探讨亚低温对氧糖剥夺/复氧后原代神经元细胞自噬和凋亡的影响,运用原代神经元培养及OGD/R模型构建,CCK8测定细胞活力,TUNEL检测细胞凋亡,Western-blot检测Sirt1、Foxo1、Rab7、Beclin1、LC3及p53等蛋白的表达,以及转染mRFP-GFP-LC3自噬双标腺病毒检测神经元自噬流等方法,成功培养原代神经元及构建OGD/R模型。结果发现OGD/R后Sirt1、P-Foxo1、Rab7、Beclin1、LC3b/LC3a表达随着时间延长逐渐减少,12 h更明显,与R6 h组相比,P<0.05,而p53增加,P<0.05;OGD3 h/R12 h,亚低温组Sirt1、P-Foxo1、Rab7、Beclin1及LC3b/LC3a表达均明显高于常温组,P<0.05,而p53明显低于常温组,P<0.05。R6 h亚低温组,神经元凋亡率为20%±6.7%,低于常温组的56.8%±7.6%,P<0.05。mRFP-GFP-LC3自噬双标观察法显示亚低温组自噬溶酶体明显增多,P<0.05。实验显示原代神经元OGD/R后亚低温干预可以上调Sirt1的活性,增加Foxo1、Rab7和自噬相关蛋白Beclin1、LC3b/LC3a的表达,同时抑制p53,促进神经元自噬,减少凋亡。

亚低温对氧糖剥夺神经元细胞自噬的影响

目的:观察亚低温治疗对氧糖剥夺神经细胞凋亡和自噬的影响。方法:提取SPF级SD大鼠新生鼠(1d内)大脑皮层神经元细胞,建立氧糖剥夺/复糖复氧(OGD/R)模型。OGD 3 h后从细胞培养盒中取出细胞培养板,分别置于37℃或34℃恒温培养箱中复氧6 h、12 h。western-blot检测凋亡蛋白P53蛋白和自噬相关蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1、Atg5和Rab7的表达。Tunel法检测神经元细胞凋亡。结果:新生鼠原代神经元分离、培养、接种4h后贴壁良好。常温组,原代神经元OGD3h,复氧后6h和12h,western-blot Rab7表达逐渐减少;Beclin1表达减少;LC3Ⅱ/Ⅰ比值减少;Atg5表达也有所减少;而P53蛋白表达明显增加,P均<0.05。相对于常温组,OGD3h,复氧后12 h,亚低温组Rab7,Beclin1,Atg5蛋白表达均高于常温组,P<0.05;而P53蛋白表达低于常温组,P<0.05。Control组、R6h常温组、R6h低温组神经元凋亡率分别为10.2%±3.6%、56.8%±7.6%、20%±6.7%,P<0.05。结论 :原代神经元细胞氧糖剥夺/复氧后,神经元自噬明显减少,凋亡增加;亚低温治疗可促进自噬,减少凋亡。

亚低温促进神经元自噬减轻小鼠脑缺血-再灌注损伤

目的探讨小鼠全脑缺血-再灌注（ischemia／reperfusion，I／R）损伤后神经元自噬和凋亡的情况，以及亚低温对神经元自噬和凋亡的影响。方法颈动脉结扎方法建立C57小鼠全脑缺血-再灌注损伤（I／R）模型，C57小鼠共96只，随机（随机数字法）分为8组（n=12）：①正常对照组（CO）；②假手术组（sham）；③I／R后正常体温（37℃）6h组（C6h）；④I／R后正常体温12h组（C12h）；⑤I／R后正常体温72h组（C72h）；⑥I／R后亚低温（34oC）6h组（C6h＋MH）；⑦L／R后亚低温12h组（C12h＋MH）；⑧I／R后亚低温72h组（C72h＋MH）；Western—blot检测各组各时间点Sirtl、P-FoxOl、Rab7、P53、Beclinl、LC3等的表达；免疫荧光检测LC3颗粒的数量；TUNEL染色观察神经元凋亡。采用SPSS13．0进行统计分析。计量资料用均数．4-标准差（x±s）表示，多组间计量资料比较用单因素方差分析（LSD—t），以P〈0．05为差异有统计学意义。结果Western—blot显示，正常体温组I／R后，Sirtl、P-FoxO1、Rab7、Beclin1表达随着时间延长逐渐减少，12h更明显，与正常对照组相比，差异有统计学意义（P〈0．05）；LC3II／I比值逐渐减少（P〈0．05）；而P53表达明显增加（P〈0．05）；亚低温组Sirt1、P-FoxO1、Rab7、Beclin1、LC3Ⅱ／Ⅰ表达均高于正常体温组（P〈0．05）；而P53表达低于正常体温组（P〈0．05）。免疫荧光检测显示，正常体温组I／R后12h，神经元LC3颗粒较正常对照组明显减少（6．0±1．5和18．1±2．5，P〈0．05）；而亚低温组LC3颗粒较正常体温组明显增加（36．1±4．5和6．0±1．5，P〈0．05）。TUNEL检测结果显示，正常体温组I／R后72h，神经元细胞凋亡较对照组明显增多[（54．8±7．5）％和（5．5±1．2）％，P〈0．05]；而亚低温组神经元凋亡较正常体温组明显减少[（28．8±4．5）％和（54．8±7．5）％，P〈0．05]。结论小鼠全脑缺血．再灌注损伤后，神经元自噬减少，凋亡增加；亚低温干预可以上调Sirt1的活性，增加FoxO1、Rab7和自噬相关基因Beclin1、LC3的表达，同时抑制P53，促进神经元自噬，减少凋亡，为缺血-再灌注后脑损伤提供新的治疗靶点。

亚低温对心肺复苏后大鼠海马CA1区神经元细胞自噬的影响

目的观察亚低温对自主循环恢复后（ROSC）大鼠海马CA1区神经元细胞自噬的影响。方法36只Wistar大鼠随机（随机数字法）分为常温治疗组和亚低温治疗组，心外膜致颤法建立大鼠心脏骤停（cardiac arrest, CA）心肺复苏模型，ROSC后2 h和4 h每组各处死3只动物取大脑皮层，Western blot方法观察p-AMPK和自噬标志物Beclin-1、LC3的表达，免疫荧光观察LC3颗粒的形成。ROSC后24、48和72 h分别进行神经功能缺损（neurologic deficit score，NDS）评分，ROSC后72 h处死动物取大脑进行TUNEL染色计算海马CA1区神经元细胞凋亡指数。结果常温组ROSC后2 h和4 h p-AMPK、Beclin-1表达水平以及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比例均低于Hypothermia组（P〈0.05）;亚低温组CA1区神经元胞浆内可见明显的LC3颗粒形成；ROSC后24 h、48 h、72 h常温组和亚低温组大鼠的NDS评分分别为320 vs. 205、285 vs. 140、266 vs. 120，ROSC后72 h常温组CA1区神经元细胞凋亡指数高于亚低温组（P〈0.05）。结论心肺复苏后亚低温治疗可促进大鼠海马神经元细胞自噬，减少神经元细胞凋亡。