P物质通过p38MAPK途径激活小胶质细胞参与大鼠热痛敏感的形成

目的观察P物质激活脊髓小胶质细胞过程中p38MAPK的磷酸化,以及活化的脊髓小胶质细胞在参与大鼠热痛觉敏感产生的作用。方法以离体培养的原代脊髓小胶质细胞为研究对象,用P物质直接孵育培养原代脊髓小胶质细胞;免疫荧光化学法检测形态变化观察P物质处理后的脊髓小胶质细胞的活化,免疫荧光化学法检测P物质处理的脊髓小胶质细胞p38MAPK的磷酸化。将P物质激活的小胶质细胞和未处理的对照小胶质细胞分别注入SPF级雄性SD大鼠(体质量180-200 g,n=6)脊髓蛛网膜下腔,通过检测大鼠缩足反射潜伏期观察对热痛敏感的影响。结果 P物质作用于原代培养的脊髓小胶质细胞后,小胶质细胞活化,表现为形态改变:突起回缩,胞体变大,标志性抗原OX-42表达增多,同时磷酸化的p38MAPK也增多;与注射前[(10.91±0.51)s]相比,注射活化的小胶质细胞的大鼠热刺激缩足反射潜伏期从6 h[(8.65±0.35)s]开始缩短,并可持续至24 h[(7.38±0.29)s](P<0.05)。结论 P物质通过激活p38MAPK信号通路活化脊髓小胶质细胞参与大鼠脊髓热痛觉敏感的形成。

P物质刺激脊髓小胶质细胞释放肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-1β的作用观察

目的探讨P物质对脊髓小胶质细胞的作用。方法利用原代培养的脊髓小胶质细胞,P物质孵育后采用免疫组织化学方法观察细胞形态学改变,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)方法观察细胞释放肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-1β(IL-1β)的情况。结果 P物质孵育后,小胶质细胞表现出激活态的形态学改变,400μmol/L和800μmol/L的P物质孵育6 h后,TNF-α和IL-1β释放增多,12 h时达到高峰,之后逐渐下降。结论 P物质作为脊髓水平传递痛信号的重要神经递质,可以刺激活化脊髓小胶质细胞,促进小胶质细胞合成释放TNF-α和IL-1β,并最终促进慢性痛敏的形成。

P物质对星形胶质细胞胞内钙离子浓度和白细胞介素10释放的作用观察

目的探讨P物质对星形胶质细胞的直接作用。方法利用原代培养的星形胶质细胞,P物质孵育后,采用免疫细胞化学的方法观察细胞形态的变化,采用细胞内钙离子成像方法记录P物质作用前后胞内钙荧光强度的变化。采用酶联免疫吸附试验检测细胞释放白细胞介素(IL)-10的情况。结果 P物质孵育后,星形胶质细胞表现出激活态的形态学改变,P物质孵育后引起星形胶质细胞内Ca2+浓度增加,星形胶质细胞释放抗炎因子IL-10减少。结论脊髓水平传递痛信号的神经递质P物质可刺激活化脊髓星形胶质细胞,活化的星形胶质细胞通过抑制抗炎因子IL-10的释放,最终导致慢性疼痛的发生。

老年大鼠脊髓小胶质细胞分选新方法及功能特征观察

目的:建立分离纯化老年大鼠小胶质细胞的改良方法,并初步观察老年大鼠脊髓小胶质细胞的生物学特性。方法:以年轻SD大鼠(2月龄)为对照组,采用胰酶、胰酶替代物和机械网搓法等不同的制备方法,制备大鼠小胶质细胞的单细胞悬液,通过检测细胞纯度、存活率,观察细胞形态特征,分析细胞的炎性功能特征等,确定老年大鼠(20月龄)小胶质细胞的分离纯化方法,观察老年大鼠脊髓小胶质细胞功能特征。结果:胰酶消化所得细胞的存活率低(年轻大鼠83%,老年大鼠60%);机械网搓法虽得到的存活率较高(95%),但是细胞获取率最低(年轻大鼠((0.207±0.020)×10^(6),老年大鼠(0.243±0.023)×10^(6));采用胰酶替代物解离、密度梯度离心方法分选出的老年大鼠脊髓小胶质细胞数量多、活性好、存活率高,细胞纯度可达85%以上,我们采用此方法分选纯化不同年龄大鼠脊髓小胶质细胞,与年轻大鼠相比,老年鼠脊髓组织量大,所需消化液多,但消化时间缩短;与年轻大鼠小胶质细胞相比,老年大鼠脊髓小胶质细胞其胞体较大较圆,突起少且粗短,形态上偏向于激活状态,老年大鼠小胶质细胞促炎因子IL-1β表达降低(P<0.05),而抗炎因子IL-10(P<0.01)表达升高。结论:成功建立胰酶替代物解离结合密度梯度离心法从大鼠脊髓组织中分离纯化小胶质细胞,老年大鼠脊髓内小胶质细胞整体表现出抗炎表型。