结直肠癌组织中NR2F1的表达及其与预后的相关性

目的检测结直肠癌中核受体亚家族2组F成员1(NR2F1)的蛋白表达水平,并探讨其与患者预后的关系。方法选择2012年8月至2013年9月在苏州市立医院进行根治性切除术的56例结直肠癌患者作为研究对象,采集患者的结直肠癌组织标本及对应的癌旁组织标本。采用EnVision法测定结直肠癌组织和癌旁组织的NR2F1的蛋白表达水平,比较不同NR2F1蛋白表达水平结直肠癌患者的临床病理特征。采用Kaplan-Meier法绘制结直肠癌患者的生存曲线,分析NR2F1蛋白表达水平与结直肠癌的预后的相关性。结果结直肠癌组织的NR2F1高表达率为48.21%,明显高于癌旁组织的7.14%,差异有统计学意义(P<0.05);NR2F1高表达者的无脉管侵犯率为85.19%,明显高于NR2F1低表达者的58.62%,差异有统计学意义(P<0.05);NR2F1高表达患者突破浆膜层的占比为48.15%,明显低于NR2F1低表达者的65.52%,且随着浸润深度从固有肌层到突破浆膜层,NR2F1低表达增加,差异均具有统计学意义(P<0.05);NR2F1高表达和低表达患者在性别、年龄、肿块大小、分化程度、淋巴结转移方面比较,差异均无统计学意义(P>0.05);经Kaplan-Meier生存曲线分析结果显示,结直肠癌的NR2F1高表达患者的10年总生存率为26.79%,明显高于NR2F1低表达患者的17.86%,差异有统计学意义(P<0.05)。结论结直肠癌的NR2F1表达升高,NR2F1可能参与了结直肠癌的发生、侵袭,对患者的预后造成一定的影响。

人4-1BBL转基因细胞株的构建及其生物学功能的研究

目的为探讨人4-1BBL分子的生物学功能,构建人4-1BBL转基因细胞株。方法利用RT-PCR方法克隆人4-1BBL全长基因,继而重组入逆转录病毒表达载体pEGZ-Term。重组逆转录病毒载体pEGZ-Term/4-1BBL与两个辅助病毒载体用脂质体法共转染包装细胞293T,用含有完整重组逆转录病毒颗粒的293T细胞培养上清感染L929细胞,筛选获得Zeocin抗性的转基因细胞。3H-TdR掺入实验分析4-1BBL转基因细胞对T细胞增殖的影响,ELISA法分析细胞因子的分泌。结果流式细胞仪表型分析结果表明,L929/4-1BBL转基因细胞稳定表达人4-1BBL分子。体外实验表明,L929/4-1BBL细胞能够促进T细胞活化、增殖及IL-2、IL-6和IFN-γ的分泌。结论该研究成功克隆了人4-1BBL基因,构建了能稳定表达4-1BBL分子的转基因细胞株L929/4-1BBL,该株转基因细胞能提供有效的4-1BBL共刺激信号,促进T细胞活化、增殖及细胞因子的分泌。

结肠癌患者血浆外泌体表面膜结合型转化生长因子β_1表达及其生物学作用

目的观察结肠癌患者血浆外泌体(exosomes)表面膜结合型转化生长因子β_1(m TGF-β_1)表达,探讨其生物学作用。方法选取结肠癌患者20例(观察组),同期体检健康者10例(对照组),提取两组血浆exosomes,采用流式细胞仪分析exosomes表面m TGF-β_1表达。从结肠癌患者肝素抗凝全血中分离外周血单个核细胞(PBMCs),分选获得纯化的CD4^+T细胞,采用CD3、CD28诱导细胞增殖,将细胞随机分为三组,A组加入TGF-β_1阻断性单抗处理的结肠癌患者血浆exosomes(1μg/m L),B组加入Ig G1同型对照抗体处理的结肠癌患者血浆exosomes(1μg/m L),C组加入健康人血浆exosomes(1μg/m L),培养3天时进行台盼蓝染色计数活细胞数;采用ELISA法检测细胞培养上清液中TNF-α和IFN-γ水平。结果观察组血浆exosomes表面m TGF-β_1表达阳性率为36.52%±4.26%,高于对照组的9.23%±3.77%(P<0.01)。与C组比较,B组CD4^+T细胞数量及其分泌的TNF-α、IFN-γ水平均降低(P均<0.05);与B组比较,A组CD4^+T细胞数量及其分泌的TNF-α、IFN-γ水平均增加(P均<0.05)。结论结肠癌患者血浆exosomes表面高表达m TGF-β_1,m TGF-β_1表达增加可能是构成结肠癌免疫抑制环境的重要因素,可促进结肠癌的发生、发展。

CD137分子对单核细胞上CXCR4表达及功能的调节作用

目的探讨CD137分子对单核细胞上CXCR4表达及功能的调节作用。方法采用CD137-Fc融合蛋白刺激单核细胞,流式细胞术(FACS),RT-PCR方法检测CXCR4分子在单核细胞上的表达。Transwell方法分析CD137-Fc激发的单核细胞迁移能力的改变。结果FACS,RT-PCR检测结果显示,CD137-Fc刺激单核细胞48h后,CXCR4蛋白分子及mRNA的表达显著下调。Transwell实验结果显示,CD137-Fc刺激后的单核细胞对趋化因子SDF-1α的趋化能力明显下降(P<0.05)。结论CD137可下调单核细胞上CXCR4表达,进而抑制单核细胞对趋化因子SDF-1α的趋化能力。

CD137在Treg细胞上的表达及对其功能的抑制作用

目的探讨CD137分子在CD4+CD25+调节性T细胞(Treg)上的表达及其生物学意义。方法抗人CD137单抗加入PHA活化的T细胞培养体系中,流式细胞术分析细胞表型的变化,细胞计数分析细胞的增殖。结果流式细胞术分析(FACS)结果显示,PHA活化后CD137在Treg细胞表面上调表达。细胞计数结果表明,抗CD137单抗加入PHA活化的T细胞培养体系中T细胞增殖的总数明显增加,而FACS结果显示,其中Treg细胞的含量明显下降,并下调CD95的表达。结论Treg细胞活化后,CD137表达明显增加,其介导的共刺激信号可发挥抑制Treg细胞功能的作用,进而促进其它T亚群的增殖。

CD137分子对树突状细胞趋化因子分泌的调节作用

目的探讨CD137分子对树突状细胞(DCs)上趋化因子分泌的调节作用。方法采用CD137-Fc融合蛋白刺激DCs,Transwell方法分析CD137-Fc诱导DCs分泌的趋化因子对不同免疫细胞的趋化作用。RT-PCR和ELISA方法分析CD137-Fc分子对DCs上不同趋化因子mRNA表达的影响。结果Transwell实验结果显示,CD137-Fc刺激的DCs培养上清对自体T细胞、单核细胞和DCs的趋化能力明显增加(P<0.05)。RT-PCR和ELISA检测结果显示,CD137-Fc刺激DCs3d后,趋化因子MIP-1α、MIP-1β、MDC和IL-8的表达水平显著增加。结论CD137可通过诱导DCs分泌MIP-1α、MIP-1β、MDC和IL-8等趋化因子促进DC募集T细胞、单核细胞和DCs等免疫细胞,进而放大DC介导的免疫反应。

人M5型白血病-SCID小鼠模型的建立及白血病病理变化的分析

目的:建立人M5型白血病细胞系SHI-1/SCID(重症联合免疫缺陷)小鼠模型,探讨白血病细胞的接种密度与SCID小鼠成瘤率及病理变化的关系。方法:将不同密度的人白血病细胞SHI-1注射至SCID小鼠腹腔。定期尾静脉取血并以流式细胞术(FCM)监测肿瘤细胞表面标志CD14及CD137L的变化。通过病理组织学检查和FCM分析SCID小鼠的骨髓、肝脏、脾脏和肾脏中白血病细胞的浸润及病理变化。结果:将不同密度的SHI-1细胞移植至小鼠腹腔,均可发现瘤块生长。同时中、高剂量组小鼠的主要组织器官呈现不同程度的肿瘤细胞的浸润。最早在移植3周后即可在尾静脉检测到肿瘤细胞,并与注射细胞量相关。结论:建立的SHI-1/SCID小鼠模型为人M5型白血病的研究提供了有价值的动物模型。

4-1BBL分子在人急性单核细胞白血病细胞系U937和SHI-1的表达及促生长作用

目的研究4-1BBL分子在人急性单核细胞白血病细胞系U937和SHI-1的表达及促生长作用。方法用流式细胞术(FCM)和RT-PCR法检测4-1BBL分子在U937、SHI-1细胞系的表达;将激发型4-1BBL单抗(1F1)与U937、SHI-1细胞系分别进行培养,细胞计数分析2个细胞系的生长情况;收集U937细胞的培养上清,ELISA法检测细胞因子。结果FCM测得U937和SHI-1细胞有4-1BBL分子表达,RT-PCR法测得4-1BBLmRNA;细胞计数表明,1F1明显促U937、SHI-1细胞系生长(P<0·01);ELISA示1F1与U937细胞共培养48h,其上清液中IL-6含量(55·91±10·23)pg/ml,显著高于IgG1同型对照组的(12·14±3·8)pg/ml(P<0·01)。结论U937和SHI-1细胞系组成性表达4-1BBL分子;1F1与U937、SHI-1细胞的4-1BBL分子交联后,可促进U937、SHI-1细胞系生长,诱导U937细胞分泌细胞因子IL-6。

血液学指标在子宫内膜异位症相关性卵巢癌早期诊断中的研究

目的分析血液学指标在子宫内膜异位症患者与子宫内膜异位症相关性卵巢癌(EAOC)患者中的差异,探讨对内异症恶变具有诊断价值的临床指标。方法比较子宫内膜异位症患者与子宫内膜异位症相关性卵巢癌患者外周血指标(NEUT%、LYM%、MXD%、EO%、NEUT#、LYM#、MXD#、WBC、PLT、TBIL、DBIL、IBIL、ALB、CRP、CA125、HE4、NLR、MLR、PLR、ELR、CRP/ALB、SII、SIRI)的水平差异,并通过Logistic回归分析构建联合诊断指标。结果子宫内膜异位症相关性卵巢癌患者WBC、NEUT%、NEUT#、CA125、HE4、NLR、SII、SIRI均高于内异症组(P<0.05),内异症患者LYM%、ALB高于EAOC组(P<0.05)。调整了NEUT%、CA125、NLR、SII、SIRI、LYM%的影响后,WBC(P=0.023)、NEUT#(P=0.014)、HE4(P<0.001)、ALB(P=0.045)与内异症恶变发生显著相关。通过绘制ROC曲线发现,WBC、NEUT#、HE4联合诊断内异症恶变AUC(0.831)大于各指标单独诊断,并具有较高的灵敏度(81.10%)。结论WBC、NEUT#、HE4联合诊断内异症恶变具有较好的效能和一定的临床应用价值,有可能成为临床早期无创诊断子宫内膜异位症相关性卵巢癌的新方法。

B7H3分子在人髓性白血病细胞株U937和K562上的表达及生物学意义

目的:研究共刺激分子B7H3分子在人髓性白血病细胞株U937和K562上的表达及其生物学意义。方法:应用流式细胞术及RT-PCR法检测B7H3分子在人髓性白血病细胞株U937和K562上的表达;并用鼠抗人B7H3单克隆抗体(mAb)作用于U937和K562细胞株,细胞计数法检测鼠抗人mAbB7H3对U937和K562细胞株生长的影响。结果:流式细胞术分析显示U937和K562细胞株均表达B7H3膜蛋白,RT-PCR检测到U937和K562细胞有B7H3mRNA产物;鼠抗人mAbB7H3对U937和K562细胞株有抑制生长的作用。结论:U937和K562细胞株组成性表达B7H3分子;鼠抗人mAbB7H3与U937和K562细胞表面的B7H3分子交联后可以抑制白血病细胞的生长。

4-1BBL分子在人恶性血液病细胞系的表达

目的:研究共刺激分子4-1BBL分子在人恶性血液病细胞系的表达及其生物学意义。方法:流式细胞仪检测4-1BBL分子在不同的人恶性血液病细胞系的表达;用可介导4-1BBL逆向信号的鼠抗人4-1BBL单抗(mAb1F1)作用于8个不同的人恶性血液病细胞系,细胞计数法和3H-TdR掺入法评价细胞系的体外生长和增殖。结果:FACS结果显示4-1BBL分子在人恶性血液病细胞系上有不同程度的表达,其中髓性白血病细胞系U937、HL60及B淋巴瘤细胞系Raji、Daudi上呈现较高水平的表达。细胞计数和3H-TdR掺入实验结果表明mAb1F1对髓性白血病细胞系U937和HL60,具有较强的促增殖效应。结论:共刺激分子4-1BBL分子在髓性白血病细胞系和B淋巴瘤细胞系上表达率较高;4-1BBL分子可通过介导逆向信号促进髓性白血病细胞系U937和HL60的生长和增殖。

佛波酯对人视网膜神经母细胞瘤Y79细胞株表达CD133的调节作用

目的研究佛波酯(PMA)对人视网膜神经母细胞瘤表达CD133的影响。方法以人视网膜神经母细胞瘤Y79细胞株为研究对象,采用流式细胞术、RT-PCR方法检测PMA刺激后Y79细胞株CD133的表达。结果5ng/ml PMA显著增加CD133的表达,其作用在PMA刺激48h后最为明显。但与此同时,CD133mRNA表达较刺激前明显下降。H-7抑制PMA对Y79细胞的作用。结论PMA能够诱导人视网膜神经母细胞瘤Y79细胞株CD133蛋白表达增加。这一作用主要通过活化蛋白激酶C(PKC)通路来实现,而CD133抗原表达可能是转录后进行调节。

AC133-2分子的克隆及其逆转录病毒表达载体的构建

目的克隆人AC133-2全长基因,构建PGEZ-Term-AC133—2逆转录病毒表达载体。方法采用分段克隆的方法,通过聚合链式反应从胎肝文库中克隆AC133-2,并构建AC133—2基因的逆转录病毒表达载体。结果成功克隆AC133—2全长基因并构建PGEZ-Term-AC133-2逆转录病毒表达载体。结论AC133-2全长基因克隆及构建逆转录病毒表达载体的成功,为构建AC133-2转基因细胞和制备抗人AC133-2单克隆抗体和研究AC133-2的生物学功能奠定了物质基础。

FL转基因细胞的构建及膜型FL对U937细胞的体外促增殖效应

目的构建稳定表达人膜型FL分子的转基因细胞株,观察膜型FL和可溶性FL对单核细胞性(M5型)白血病细胞株的体外促增殖效应。方法利用PCR方法克隆人FL全长基因,继而重组入逆转录病毒表达载体pEGZ-Term,转染包装细胞293T,用含有完整重组逆转录病毒颗粒的293T细胞培养上清感染L929细胞,筛选获得Zeocin抗性的转基因细胞。采用RT-PCR和流式细胞仪表型分析等方法进行鉴定。MTT法分析了L929/FL细胞和可溶性FL体外刺激U937细胞的增殖效应。结果成功构建了稳定表达人膜型FL的转基因细胞L929/FL,膜型FL在体外能够有效促进U937细胞增殖,而可溶性FL并不能有效促进U937细胞的体外增殖。结论成功构建了稳定表达人膜型FL的转基因细胞,并且提示膜型FL在白血病发病机理中可能具有重要作用。

CD137L分子在人肺癌细胞系A549上的表达及其生物学功能的研究

目的研究共刺激分子CD137L分子在人肺癌细胞系A549上的表达及其生物学功能。方法流式细胞术(FACS)和RT-PCR方法检测CD137L分子在A549上的表达。采用CD137-Fc融合蛋白刺激A549上的CD137L分子,ELISA实验分析细胞因子的分泌。结果FACS实验结果显示CD137L分子表达在A549上,RT-PCR实验结果进一步证实了上述发现。ELISA实验结果显示,CD137-Fc可刺激A549 IL-8的分泌。结论A549表面CD137L分子在蛋白分子水平和mRNA水平均有表达;并可发挥调节IL-8分泌的功能。

一株抗重组人促红细胞生成素单克隆抗体杂交瘤的研制

目的 研制特异性识别人促红细胞生成素的单克隆抗体 ,并对其生物学特性作出初步鉴定。方法 采用重组人促红细胞生成素 (rhEPO)为抗原 ,常规免疫BALB/c小鼠 ,经细胞融合、ELISA筛选、有限稀释亚克隆获得抗人EPO杂交瘤 ,以免疫印迹和快速Ig亚型分类对所获单抗作出初步鉴定。结果 经筛选获得 1株稳定分泌的抗rhEPO单抗的杂交瘤细胞株 (1D1)。亚型鉴定为IgG2b ,轻链为κ链 ,用Westernblot分析证实该单抗对rhEPO特异性识别。结论 成功获得

鼠抗人OX40功能性单克隆抗体的研制及其生物学特性的鉴定

目的:研制功能性鼠抗人OX40单克隆抗体。方法:以转人OX40的转基因细胞L929-OX40为免疫原,常规免疫6-8周龄的雌性BALB/c小鼠;采用B淋巴细胞融合技术,将免疫小鼠脾脏细胞与SP2/0融合,以L929-OX40转基因细胞及PHA活化的T细胞为抗体筛选阳性细胞,经免疫荧光标记分析对杂交瘤进行反复筛选和多次的克隆化培养;采用快速定性试纸法及竞争抑制结合试验分析了该单抗的亚类及抗原识别位点;采用MTT法分析单抗在体外对T细胞的促增殖效应以及ELISA分析活化T细胞分泌的细胞因子。结果:获得1株持续、稳定分泌鼠抗人OX40单克隆抗体的杂交瘤细胞株(命名为7E11),该单抗能特异性地识别人OX40分子和介导有效的共刺激信号,体外促进活化的T细胞增殖和细胞因子的分泌。结论:成功研制成一株能分泌功能性鼠抗人OX40单克隆抗体的杂交瘤,该抗体特异性地识别人OX40分子并具有在体外协同刺激T细胞的作用。

激发型4-1BBL抗体促进原代急性髓细胞白血病细胞的增殖和MMP-9分泌

目的:研究共刺激分子4-1BBL分子逆向信号对原代急性髓细胞白血病细胞的促增殖作用及其生物学效应。方法:用流式细胞术(FCM)检测4-1BBL分子在26例初诊急性髓细胞白血病(AML)患者白血病细胞表面的表达,分离AML患者的白血病细胞并加入激发型4-1BBL抗体(1F1单抗)共培养,同时设置IgG1同型对照组,Alamar Blue法检测4-1BBL单抗1F1促AML原代细胞的增殖。收集培养细胞的上清液,用ELISA方法检测基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的水平。结果:FCM测得初诊AML患者的白血病细胞上存在4-1BBL分子的表达,26例AML患者中4-1BBL分子的阳性表达率为46.15%;1F1单抗能明显促进4-1BBL+-AML细胞的生长,4-1BBL+-AML组刺激指数明显高于4-1BBL--AML组(P<0.01)。1F1与4-1BBL+-AML细胞共培养48 h后,用ELISA法检测其上清液中MMP-9含量显著高于IgG1同型对照组[(965.06±229.94)vs(596.49±129.28)pg/ml,P<0.01],而4-1BBL--AML组的MMP-9与IgG1组无显著差异(P>0.05)。结论:部分AML患者的白血病细胞可以表达4-1BBL分子,1F1单抗与AML细胞上4-1BBL分子交联后,可以促进AML细胞的生长,同时促进MMP-9的分泌。

4-1BBL逆向信号促进单核细胞的增殖和分泌细胞因子的作用

采用抗人 4 1BBL单克隆抗体 1F1包被 2 4孔培养板 ,加入经免疫磁珠阴性选择获得的高纯度人外周血单核细胞 ,动态观察细胞的生长状态 ,并用3 H TdR掺入法分析单核细胞增殖 ,应用ELISA动态测定培养上清中IL 6、IL 10、M CSF和FL等细胞因子水平。结果发现 1F1非常有效地促进单核细胞的增殖 ,1F1组单核细胞分泌高水平的M CSF以及IL 6和FL增加 ,但 1F1组单核细胞分泌IL 10水平低于对照组 (P <0 0 5 )。由此表明 ,抗人 4 1BBL单克隆抗体 1F1通过激发单核细胞 4 BBL逆向信号 ,介导单核细胞分泌M CSF、IL 6和FL。上述细胞因子联合作用 ,从而促进了单核细胞的增殖。