新型衍生试剂柱前衍生氨基酸的高效液相色谱分析

以邻硝基苯磺酰氯为标记试剂,RP-HPLC为分析模式,建立了一种新的氨基酸衍生化方法。通过液质联用对产物进行定性,研究并确定了最佳衍生化条件：衍生温度25℃,缓冲液pH 9.0,衍生时间10 min。实验建立了20种氨基酸的HPLC分离方法：选用Kromasil C18柱,流动相A为30 mmol/L的NH4Ac溶液（pH7.5）,B相为乙腈;采用梯度洗脱,检测波长275 nm,室温。20种氨基酸在0.025-6.4 mmol/L范围内线性关系良好,相关系数在0.998 0-0.999 8之间,检出限为0.01-0.113 nmol。

对甲氧基苯磺酰氯柱前衍生生物胺的高效液相色谱分离

采用对甲氧基苯磺酰氯作为柱前衍生试剂,RP-HPLC为分析模式,建立了一种新的生物胺衍生化方法,并对葡萄酒中生物胺含量进行检测。通过液质联用对产物进行定性,研究并确定了最适衍生化条件:衍生温度50℃,缓冲液pH 9.0,衍生时间15 min。实验建立了7种生物胺的HPLC分离方法:Beckman ODS柱;流动相A为10 mmol/L的NH4Ac溶液(pH 6.37),B相为乙腈;采用梯度洗脱;流速1 mL/min;检测波长240 nm,室温。

Alcalase碱性蛋白酶酶解绿豆分离蛋白制备小分子肽的工艺研究

以绿豆为原料,用Alcalase碱性蛋白酶酶解绿豆分离蛋白制备小分子多肽。采用单因素及多因素试验方法优化酶解条件,考察酶解过程中绿豆分离蛋白预处理、料液比、酶解温度、加酶量、酶解时间等对小肽得率的影响,测定水解产物的功能特性,并用液质联用技术(LC-MS)考察酶解得到的小肽的分子量分布范围。结果表明:绿豆分离蛋白预处理条件为95℃处理20min,酶解最佳条件为:65℃、pH8.5、底物浓度9%、加酶量6000U/g、酶解240min,水解度可达35.86%。经液质联用(HPLC-MS)分析证明水解产物的分子量集中在1000u以下,绿豆分离蛋白各功能特性得到很好地改善,表明该酶对绿豆分离蛋白水解效果良好,完全能达到制备多肽的水解度要求。

HPLC法测定胸腺五肽及其有关杂质

目的:建立具有普适性的高效液相色谱法测定胸腺五肽及相关杂质。方法:采用 Kromasil-C_(18)柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),流动相为40 mmol·L^(-1)磷酸二氢钠缓冲液(pH 3.75)-甲醇(85:15),流速:1 mL·min^(-1),检测波长:210 nm。结果:线性范围为1.66～212.4 μg·mL^(-1),r=0.9998,最低检测限量为10 ng,本方法重复性和精密度良好(RSD<2%)。结论:采用HPLC 法可测定不同合成工艺合成的胸腺五肽粗肽、成品及其有关杂质,方法简便,结果准确。

反相离子对色谱法测定间苯二磺酸钠

运用反相高效离子对色谱法测定了间苯二磺酸钠。采用C18色谱柱(250mm×4.6 mmi.d.,5μm),流动相为V(乙腈)∶V(50 mmol/L NaH2PO4)=7∶93(含0.05%四丁基氢氧化铵),流速为1.0 mL/min,检测波长210 nm,柱温:30℃。间苯二磺酸钠在0.32×10-3～81.92×10-3mg/mL范围内线性关系良好,r=0.9999,加样回收率为98.8%～101.1%,RSD=0.73%(n=7)。本法为工业生产间苯二磺酸钠提供了分析方法。

应用色谱/质谱联用方法分析霉菌单加氧酶羟基化齐墩果酸体系

用反相高效液相色谱法/质谱法对天然药物齐墩果酸及其以霉菌的P450酶系作为生物催化剂的齐墩果酸羟化体系中齐墩果酸和羟化齐墩果酸进行分离分析。方法选用Lichrospher C18柱,以乙腈-水为流动相,进行梯度洗脱,用二极管阵列检测器(DAD)和电喷雾质谱(ESI-MS)为检测手段,通过色谱图和对应质谱图,确定了齐墩果酸及其羟化产物的色谱行为,建立了HPLC/DAD/ESI-MS联用法分离鉴定齐墩果酸及羟化产物的快速有效的方法。

毛细管区带电泳分离重组人红细胞生成素方法的改进

目的:针对欧洲药典收载的rhEPO毛细管电泳检测方法中pH限制严格,可操作性差的缺点,进行缓冲液组成的优化。方法:实验将响应面分析法(RSM)用于毛细管区带电泳,用最少的实验次数确定了对分离影响最大的因素,并由此确定了最佳缓冲液组成及pH范围。结果:在此优化条件下rhEPO的8个不同糖基化形式在40min内得到了基线分离,各相邻峰间的分离度达1.63～3.29,柱效达1.63×10~5～3.23×10~5理论塔板数·m^(-1),峰形良好。结论:方法具有较宽泛的pH范围,比欧洲药典更为实用。

液相色谱-质谱联用技术分析固相合成胸腺五肽及其副产物

利用反相高效液相色谱(RP-HPLC)与电喷雾质谱(ESI-MS/MS)联用技术,分析用芴甲氧羰基(Fmoc)固相合成方法在WANG树脂上手工合成的胸腺五肽(H2N-Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-COOH)粗产物,RP-HPLC结果显示:合成粗产物含有一个主要成分,三个次要成分和多个微量成分;与之联用的电喷雾质谱同步得出相应的某些信息,可对各成分的结构进行分析。结果证明,粗产物中的主成分即为目标五肽,另外几个主要副产物为五肽合成过程中去保护未完全的副产物。

液相色谱-串联质谱法用于酶法制备L-苯丙氨酸生产过程的监测

针对苯丙酮酸酶法制备L-苯丙氨酸体系,建立了液相色谱-串联质谱法定性定量检测丙酮酸、L-天氡氨酸、苯丙酮酸、L-苯丙氨酸的方法,并对质谱检测条件进行了详细探讨。色谱条件如下:流动相为乙腈、乙酸铵溶液(10mmol/L,乙酸pH5.5),等度洗脱,Eclipse CB-C8色谱柱,流速0.2mL/min,室温;质谱条件如下:电喷雾离子源,负离子MRM扫描模式,气帘气流量0.138MPa,电喷雾电压-4200V,辅助雾化气流量0.380MPa;温度500℃,干燥气流量0.380MPa。实验表明,丙酮酸、L-天冬氨酸、苯丙酮酸、L-苯丙氨酸的线性相关系数分别为0.9995、0.9984、0.9999和0.9991,平均回收率在98.8%～103%之间,相对标准偏差为4.3%～5.0%。该方法简便、快速、准确,可同时定量测定体系中4种成分的含量,为研究代谢过程和优化生产工艺提供了科学依据。

柱前衍生化-高效液相色谱法跟踪检测酶法制备γ-D-谷氨酰-L-色氨酸反应过程

γ-D-谷氨酰-L-色氨酸(SCV-07)是一种新型广谱免疫调节类化合物。针对酶法合成SCV-07反应体系的特点,以邻硝基苯磺酰氯为柱前衍生试剂,RP-HPLC为分离模式,选用Lichrospher C18柱,20mmol/L磷酸盐溶液(pH3.0)和乙腈为流动相,梯度洗脱,检测波长230nm,建立了同时分析测定多种氨基酸和小肽的方法,所有组分于15min内洗脱完毕。氨基酸及二肽在0.96～260μmol/L范围内线性良好,相关系数大于0.9991;加标回收率在97.8%～101.6%之间;相对标准偏差为1.2%～2.9%。本方法适用于SCV-07产品的纯度分析,以及酶法转肽制备SCV-07反应过程跟踪检测,具有分析速度快,准确度高、操作简单等优点。

酶法生产L-苯丙氨酸体系的液相色谱-质谱联用分离分析

通过对高效液相色谱各主要分离条件以及质谱分析条件的优化,建立了一种有效的液质联用方法分析酶法生产L-苯丙氨酸体系中3种主要成分:L-天冬氨酸,丙酮酸和L-苯丙氨酸。该方法抗干扰能力强,简单、快速、准确、灵敏且重现性好,适用于定性及定量分析实际样品,为生产工艺优化和生产过程研究提供了依据。

应用FIA型微生物传感器测定谷氨酸含量的研究

目前应用酶或微生物细胞作为分子识别元件构建生物传感器测定谷氨酸含量的研究引起了广泛的兴趣,并陆续有实例报道。在这些报道中人们依据不同的酶催反应选择相应的离子选择性电极,如CO_2电极、NH_4^+电极等,而测量对象有直接的测定谷氨酸,也有测定谷氨酸单钠的间接测定法。本文选用了可固定大量细胞的固定化细胞柱与流动注入法相结合的测量方法。

FIA型微生物探针动态响应过程的研究Ⅰ──谷氨酸的测定

将固定化细胞柱和简单的流动注射系统相结合，以大肠杆菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）为工作菌株配合ＣＯ＿２选择性电极，制成谷氨酸微生物传感器。它具有以下特性：传感器对谷氨酸溶液的适用测量浓度范围为４００～２０００ｍｇ／Ｌ谷氨酸；一个样品的检测在２０ｍｉｎ内完成；固定化细胞柱的使用寿命在４周以上；除Ｌ－精氨酸和Ｌ－谷氨酰胺外，其余氨基酸均不干扰传感器对谷氨酸的测定。

FIA型微生物探针动态响应过程(Ⅱ)正交配点法的应用

在已建立的Ｌ－谷氨酸检测体系的基础上，为克服电极不稳定性给测量带来的误差，根据全混流型生物反应器的特点，建立了适用于固定化细胞柱的数学模型，采用正文配点法对数学模型进行了估算，并以Ｌ－谷氨酸微生物传感器为例，提出了浓度测量值的计算方法．

毛细管电泳法分析藏红花植物细胞多糖中单糖组成

以对甲氧基苯胺为衍生试剂,采用毛细管电泳法分析了藏红花植物细胞多糖中的单糖组成。对衍生条件进行了优化,并对毛细管分离条件进行了系统的研究。衍生反应在醋酸含量9.5%(v/v)、80℃下反应2 h的衍生产率最大,衍生产物紫外检测波长234 nm。在优化的毛细管电泳分离条件(未涂层熔融石英毛细管柱(60 cm(有效长度50 cm)×50μm),柱温25℃,电压20 kV,使用350 mmol/L硼酸电解液(pH 10.21),压力(3.447 5 kPa)进样5s)下,基线分离了11种结构相近的醛糖(来苏糖、木糖、核糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、鼠李糖、纤维二糖、麦芽糖、乳糖)、酮糖(果糖)的衍生产物。应用该方法定量检测了藏红花植物细胞多糖水解物中糖的成分,各糖的回收率为94.3%～105.4%,相对标准偏差为3.3%～4.6%。

5-取代海因的消旋过程对化学酶法制备D-氨基酸的影响

海因酶是化学酶法制备光学活性氨基酸的关键酶,今研究通过采用不同旋光性的底物进行了海因酶底物光学特异性的研究。结果表明,本体系采用的海因酶是D-海因酶,具有严格的光学选择性;提出了L-海因消旋是以混旋海因制备D-氨基酸的重要限速步骤;以L-5-甲基海因为对象,研究了L-海因的消旋过程,对其动力学过程进行了分析。研究表明,L-海因消旋符合一级反应动力学过程;并结合实验提出增高温度和pH值均有助于提高转化效率。

绿豆皮中黄酮类化合物提取工艺

研究了绿豆总黄酮的提取工艺。通过对固液比、乙醇体积分数、提取温度与提取时间的单因素实验确定水平点,设计4因素3水平实验,选用L9(34)正交表,优选绿豆总黄酮的最佳提取工艺为固液比1∶50,φ(乙醇)为40%,提取温度70℃,提取时间120 m in。在此基础上得到绿豆皮中总黄酮的提取量为27.57 mg/g,且5次平行的相对标准偏差为0.75%,总黄酮的平均回收率达97.5%。

HPLC法测定酵母RNA降解的4种核苷酸

采用反相高效液相色谱 (HPL C)分离了酵母 RNA降解的 4种核苷酸。检测波长为 2 5 4 nm,流动相为2 0 mm ol· L- 1 (NH4 ) H2 PO4 。方法精密度分别为 RSDCMP=1.79% ,RSDUMP=0 .36 % ,RSDGMP=0 .79% ,RSDAMP=0 .5 7% ,测得的 4种核苷酸的回收率分别为 98.9% ,99.1% ,10 0 .8%和 99.9%。

毛细管电泳法测定葡萄酒中的有机酸含量

运用毛细管区带电泳法直接测定了葡萄酒中酒石酸、苹果酸、柠檬酸、琥珀酸、乳酸、乙酸、富马酸、草酸8种有机酸,并研究了缓冲液种类、缓冲液浓度、pH值、表面活性剂、电泳电压、电泳温度对分离度的影响。方法线性范围较宽,各有机酸线性相关系数在0.9990～0.9998之间,有机酸迁移时间及峰面积的RSD分别为0.68%～1.02%及3.68%～5.41%,方法回收率为91.9%～116.9%。方法简便、快速、准确,可对葡萄酒酿造过程快速监控,并对酒的品质进行监测。

胸腺五肽肽库制备及其免疫活性分析

目的合成胸腺五肽D型氨基酸取代肽库,并测定对T淋巴细胞的免疫活性。方法利用组合化学技术,采用简便的茶袋法固相合成制备肽库化合物,对得到的粗肽进行分离纯化,质谱和高效液相色谱(HPLC)测定纯度,免疫活性测定采用氚标记胸腺嘧啶掺入法。结果粗肽得率平均在54%左右。通过HPLC分离得到纯肽,经质谱及HPLC分析,所制类似物相对分子质量与胸腺五肽一致,精制后的肽得率平均在36.4%左右。对T淋巴细胞增殖反应的影响作用发现,肽库中两个类似物具有明显刺激T淋巴细胞增殖的活性作用。结论D-氨基酸置换的胸腺五肽类似物对T淋巴细胞的免疫调节作用比胸腺五肽作用更强。