人鼻咽癌顺铂耐药细胞系(CNE2/DDP)的建立及耐药相关基因的筛选

背景与目的:化疗是鼻咽癌最主要的辅助治疗手段,然而癌细胞耐药性的产生常常导致药物治疗的失败,因此,筛查鼻咽癌耐药相关基因、寻找逆转药物耐受的分子靶点具有重要的现实意义。本研究首先用鼻咽癌药物敏感细胞CNE2作为亲本细胞诱导建立耐药细胞系,并在此基础上,筛选鼻咽癌耐药相关基因,探讨耐药性产生的分子机制。方法:以顺铂(cisplatin,DDP)为诱导剂,采用大剂量冲击与剂量逐渐递加相结合的方法,诱导建立人鼻咽癌耐药细胞系CNE2/DDP。采用MTT法测定药物的敏感性、流式细胞术测定细胞周期及细胞内荧光药物罗丹明的蓄积,并进行细胞生长曲线测绘、倍增时间测定及细胞形态学观察。随后,采用基于PCR技术改良的消减杂交法筛选并克隆耐药相关基因。反向点杂交鉴定排除假阳性,DNA测序分析差异表达片段,RT-PCR对差异表达的基因片段做进一步验证。结果:所建立的人鼻咽癌耐药细胞系CNE2/DDP对DDP的耐药指数为27.9,对5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)及长春新碱(vincristine,VCR)的耐药指数分别可达227.9和55.5,表明其具有多药耐药的特征。流式细胞测定显示耐药细胞内罗丹明的蓄积明显低于敏感细胞(12.98vs.243.62)。镜下观察耐药细胞体积变小,形态变圆,细胞倍增时间明显延长(26hvs.19h)。

人鼻咽癌顺铂耐药细胞系(CNE2/DDP)及其亲代细胞(CNE2)的比较基因组杂交研究

背景与目的:比较基因组杂交(comparativegenomichybridization,CGH)是一种在荧光原位杂交(FISH)技术上发展起来的,用于检测两个基因组间相对DNA拷贝数的改变(缺失或扩增),并将这些变化在染色体上进行定位的分子细胞遗传学方法。为全面了解鼻咽癌耐药细胞与药物敏感细胞在基因组DNA水平上可能存在的差异,以及这种差异在肿瘤耐药性产生中的意义,我们用CGH技术对鼻咽癌耐药细胞系(CNE2/DDP)和其亲代药物敏感细胞(CNE2)的基因组DNA进行检测和分析。方法:提取两种癌细胞及正常胎盘组织的基因组DNA,以随机引物法进行荧光标记(CNE2/DDP和CNE2DNA以Fluorescein-12-dUTP标记,探针显绿色荧光;正常胎盘组织以Tetramethylrhodamine-5-dUTP标记,探针显红色荧光),将标记的DNA探针同时与正常淋巴细胞分裂中期染色体进行杂交,杂交信号在荧光显微镜下经CCD(chargecoupleddevice)摄像装置摄取,并通过荧光数字图像分析系统(quipsCGHprogram)进行数据处理,计算两种荧光的比率并绘制分析图。结果:CNE2细胞存在广泛的染色体改变,主要表现在1q,3q,5p,6p,7p,8q,9q,11p,12q,19q的扩增和4q,12p,13p,14p,15p,18,20q,21p,22的缺失。从CNE2诱导的耐药细胞系CNE2/DDP恒定表现为8q,19q的扩增和8p的缺失,其它的染色体均未发现明显异常的?

携带IL-12的增殖腺病毒对鼻咽癌细胞的杀伤作用

目的 肿瘤选择性增殖腺病毒携带小鼠白细胞介素 1 2 (mIL1 2 )基因 ,增强对鼻咽癌细胞的杀伤作用。方法 用非增殖腺病毒Ad LacZ测定腺病毒对鼻咽癌细胞CNE3和 91 5的转染率 ,用E1B 55 0 0 0u蛋白缺失的腺病毒dl1 52 0和E1B 55 0 0 0u蛋白缺失的腺病毒CNHK2 0 0 mIL1 2分别转染培养的CNE3和 91 5 ,并瘤内注射到裸鼠皮下的CNE3移植瘤。结果 Ad LacZ病毒数量与细胞数量之比 (MOI)为 1 0 0时 ,转染率分别为 63 %和 56 % ;MOI为 1 0时 ,分别为 1 2 %和 8%。在体外不加入淋巴细胞的条件下 ,CNHK2 0 0 mIL1 2和dl1 52 0在MOI为 1 0 0时都可在 7d内完全杀灭鼻咽癌细胞CNE3和 91 5。对裸鼠CNE3移植瘤 ,CNHK2 0 0 mIL1 2治疗组疗效显著高于dl1 52 0治疗组 (P <0 .0 5) ,表明在选择性腺病毒中插入mIL1 2增强了其杀伤功能。结论 选择性增殖腺病毒携带mIL1 2后能够增强病毒对鼻咽癌细胞的杀伤作用 ,为鼻咽癌临床治疗探索一种新的基因病毒治疗方法。

恶性肿瘤治疗的新策略——基因-病毒治疗

本文较系统地介绍了几种增殖病毒治疗肿瘤的最近进展 ,目前最为有效的增殖病毒是ONYX 015 ,它与常规化疗联合 ,可产生令人鼓舞的临床疗效。但单独应用 ,其病毒杀伤力仍不足 ,从而提出了一种新型的肿瘤治疗新策略 ,即基因 病毒治疗法 ,该方案充分利用增殖病毒及基因治疗的优势 ,它可能成为肿瘤治疗最有效的方案之一。

携带mIL-12基因的增殖腺病毒在鼻咽癌细胞中增殖及mIL-12高效表达

目的联合选择性增殖腺病毒溶肿瘤细胞和小鼠白细胞介素12(mouse interleukin-12, mIL12)免疫治疗的作用,提高对肿瘤细胞的杀伤作用。方法用携带mIL12的选择性增殖腺病毒CNHK200-mIL12转染鼻咽癌细胞株CNE3和915,测定其在鼻咽癌细胞株中的增殖能力和mIL12的表达水平。结果CNHK200-mIL12转染鼻咽癌细胞后,免疫组化染色显示大部分细胞腺病毒六联体蛋白(hexon)阳性,用流式细胞仪检测,转染24 h 后CNE3和915细胞的阳性率分别比0 h增高39%和4%,转染72 h后,病毒增殖超过1 000倍,增殖能力同dl1520相似,并能高水平表达mIL12,在1×104个CNE3和915细胞中分别达到(84.5±4.6)和(75.6±3.4)ng/105空斑形成单位(plaque forming unit, PFU)。结论携带mIL12 的CNHK200在p53缺陷的鼻咽癌细胞中增殖,并且高效表达mIL12,为进一步研究体内外对肿瘤杀伤作用奠定基础。

放射性金粒经软颚种植治疗残存及复发鼻咽癌71例临床报道

目的评价￣（１９８）Ａｕ种植治疗残存及复发鼻咽癌的临床疗效及应用。材料与方法１９８６～１９９４年，应用放射￣（１９８）Ａｕ金粒经软颚切开植入鼻咽腔治疗７６例残存或复发鼻咽癌，肿瘤直径大小０．５～５ｃｍ，放射性金粒植入数为４～１４粒。结果可供评价的患者７１例，其中局部残存２５例，局部复发４６例。残存组与复发组治疗后局部控制率分别是８７．５％及４９．３％（Ｐ＞０．０１４），两组治疗后６年实际生存分别是７６％及３５．２％（Ｐ＞０．００９）。结论放射性金粒植入治疗残存及复发异咽癌是一较好的有效挽救性治疗手段。本组鼻咽癌残存疗效好于复发，提示鼻咽癌放疗后应注意早期随访，复发患者区域淋巴结及远转率较高，应进一步研究其它预防性治疗措施及方法。

基因-病毒载体的研制及其抗肿瘤作用的初步研究

目的 研究一种结合肿瘤基因治疗与病毒治疗优势的新型肿瘤治疗载体系统 ,即基因 病毒载体系统。方法 利用病毒重组技术将抗癌基因插入肿瘤细胞特异性的增殖病毒的病毒基因组中 ,通过细胞病理作用、荧光显微镜、免疫酶链技术及电镜等技术分别观察病毒的杀伤效应、报告基因绿色荧光蛋白、抗癌基因小鼠白细胞介素 12表达量及病毒复制情况。结果 构建了一种新型基因 病毒载体系统 ,该载体系统腺病毒E1b 5 5 0 0 0蛋白缺失 ,保留了腺病毒E1a蛋白。该载体系统具有肿瘤增殖病毒ONYX 0 15的相似功能 ,即它可在肿瘤细胞内复制及增殖 ,而在正常细胞内不能复制及增殖 ,从而特异性杀灭肿瘤细胞。该载体系统还可携带各种抗癌基因以进一步提高抗肿瘤的疗效。应用该载体系统携带该报告基因绿色荧光蛋白可使绿色荧光蛋白在肿瘤细胞内高效表达 ,其表达量明显高于传统基因治疗的腺病毒载体系 ,而在正常细胞内低表达 ,表达量与传统腺病毒载体系统相似或更低。应用该载体系统携带抗癌基因小鼠白细胞介素 12 ,也产生类似结果。电镜也证实该载体系统携带抗癌基因小鼠白细胞介素 12可在肿瘤细胞株中复制及增殖。结论 基因 病毒载体将抗癌基因插入肿瘤增殖病毒基因组 ,可数百倍乃至上万倍提高抗癌基因的表达量 。

局部晚期鼻咽癌同期放化疗的疗效分析

目的评估同期放化疗方案对局部晚期鼻咽癌患者的疗效、急性毒性反应、依从性和晚期损伤情况。方法74例Ⅲ、Ⅳ期中国人种局部晚期鼻咽癌患者,按照北美Intergroup0099方案接受了同期放疗加辅助化疗的治疗,其急性与晚期毒性反应采用美国放射治疗协作组织(RTOG)的标准进行评价。结果74例患者的5年生存率和无瘤生存率分别为71.3%和43.5%。无5级毒性反应发生,3,4级急性毒性反应主要为造血系统25例,占33.8%;咽部黏膜19例,占25.7%;放疗区皮肤损伤6例,占8.1%。完成放疗、同期放化疗和全部化疗者分别为100.0%、75.7%和47.3%;3～4级晚期并发症主要为唾液腺损伤(17例)、听力损伤(13例)、皮肤及皮下组织损伤(7例),晚期损伤的5年累积发生率为44.3%。结论与常规放射治疗相比,同期放化疗方案有助于中国人种局部晚期鼻咽癌患者疗效的提高,其急性毒性反应有所增加,晚期损伤基本相同。

基因-病毒治疗系统CNHK200-hA的构建及体外初步研究

目的 构建一种结合抗肿瘤新生血管生成的基因治疗与病毒治疗优势的新型肿瘤基因 病毒治疗系统CNHK2 0 0 hA。方法 克隆人抗血管生成基因Angiostatin(k1 5 ) ,命名为hA。利用病毒重组技术将hA插入肿瘤特异性增殖病毒的病毒基因组中 ,通过病毒增殖试验、电镜技术、Westernblot分析、鸡胚尿囊膜试验 (CAM ) ,观察CNHK2 0 0 hA的复制情况、hA基因的表达及其对新生血管生成的抑制作用。结果 构建了一种新型的基因 病毒治疗系统CNHK2 0 0 hA。该治疗系统为E1b 5 5× 10 3 蛋白缺失而保留了腺病毒E1a蛋白的 5型腺病毒 ,能在肿瘤细胞内大量增殖及复制 ,而在正常细胞内增殖能力较弱 ,从而特异性杀灭肿瘤细胞。同时CNHK 2 0 0 hA携带人抗肿瘤新生血管生成基因hA ,能在肿瘤细胞内高效表达hA蛋白 ,其表达量高于传统基因治疗的腺病毒载体系统。电镜证实该治疗系统可在肺癌A5 49细胞株中复制及增殖。CAM试验证实该治疗系统感染肺癌细胞后的培养液上清具有抗新生血管生成的生物活性。结论 基因 病毒治疗系统CNHK2 0 0 hA能在肿瘤细胞中增殖复制 ,并明显提高hA基因的表达量 ,表达产物具有抑制新生血管形成的作用。

肿瘤靶向且高效表达抗癌基因的基因 病毒载体系统(英文)

目的 研究一种结合肿瘤基因治疗与病毒治疗优势的新型肿瘤治疗载体系统 ,即基因 病毒载体系统。方法 利用病毒重组技术将抗癌基因插入肿瘤细胞特异性的增殖病毒基因组中 ,通过细胞病理作用、荧光显微镜、免疫酶链技术及电镜等技术分别观察病毒的杀伤效应、报告基因绿色荧光蛋白、抗癌基因小鼠白细胞介素 12表达量及病毒复制情况。结果 构建了一种新型基因 病毒载体系统 ,该载体系统腺病毒E1b 5 5kDa蛋白缺失 ,保留了腺病毒E1a蛋白。该载体系统具有肿瘤增殖病毒ONYX 0 15相似功能 ,即它可在肿瘤细胞内复制及增殖 ,而在正常细胞内不能复制及增殖 ,从而特异性杀灭肿瘤细胞。它还具有更大的优势 ,即该载体系统可携带各种抗癌基因以进一步提高抗肿瘤的疗效。应用该载体系统携带该报告基因绿色荧光蛋白可使绿色荧光蛋白在肿瘤细胞内高效表达 ,其表达量明显高于传统基因治疗的腺病毒载体系 ,而在正常细胞内低表达 ,与传统腺病毒载体系统相似或更低。应用该载体系统携带抗癌基因小鼠白细胞介素 12 ,也产生类似结果 ,并在电镜中证实该载体系统携带抗癌基因小鼠白细胞介素 12可在肿瘤细胞株中复制及增殖。结论 基因 病毒载体是将抗癌基因插入肿瘤增殖病毒基因组 ,通过肿瘤增殖病毒在肿瘤细胞内特异性复制?

以血清EB病毒抗体谱评估患鼻咽癌危险度的研究

目的 比较鼻咽癌患者与健康人群血清EB病毒抗体水平 ,评估患鼻咽癌的危险度。方法 收集珠江口地区 12 1例鼻咽癌患者和 332例健康人血清。采用酶联吸附试验 (ELISA)检测血清中EBNA 1 IgA、EBNA 1 IgG和zta IgG ,以免疫酶法或免疫荧光法检测VCA IgA。结果 EBNA 1 IgA、EBNA 1 IgG和zta IgG的敏感度分别为 85 %、83%和 79% ;三者组合的敏感度最高 ,为 92 %。EBNA 1 IgA、EBNA 1 IgG和zta IgG的特异度分别为 86 %、86 %和 80 % ;三者组合的特异度最高 ,为 93%。根据优势比水平 ,可将患鼻咽癌的危险度分为低危险、中危险和高危险 3个层次。 93%的健康人是低危险的 ,优势比为 0 .0～ 0 .3;0 .4 %的健康人是高危险的 ,优势比为 137.9。结论 ELISA在诊断鼻咽癌的结果判断上更具客观性 ,较传统免疫酶法好 ;EBNA 1 IgA、EBNA 1 IgG和zta IgG的联合应用可以评估人群患鼻咽癌的危险度。