无尾两栖类抗肿瘤肽的研究进展

无尾两栖类动物所含有的生理活性物质数量巨大、种类繁多、功能复杂,是发掘天然抗肿瘤肽的巨大资源库。本文主要概述了无尾两栖动物中抗肿瘤肽的组织分布、分类、理化性质及主要作用机制,为开发两栖类动物多肽有效成分提供理论参考。

AT1-AA通过氧化应激诱导心肌H9c2细胞自噬及凋亡

目的:本研究旨在探讨血管紧张素Ⅱ1型受体自身抗体(AT1-AA)对心肌H9c2细胞氧化应激、自噬及凋亡的影响,并分析其可能机制。方法:体外常规培养大鼠心肌H9c2细胞,CCK-8法检测不同浓度和不同时间作用条件下AT1-AA对细胞存活率的影响,从而确定其最佳作用浓度(10-5 mol/L)和作用时间(24 h);在最佳浓度和时间下,Western blot检测细胞自噬和凋亡相关蛋白的表达,氧化应激试剂盒检测谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)的变化。结果:AT1-AA可浓度及时间依赖性地降低细胞活力,促进细胞凋亡,同时上调细胞自噬和氧化应激的水平(P<0.05);自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤预处理细胞后,AT1-AA诱导的心肌H9c2细胞凋亡减少(P<0.05);氧化应激抑制剂α-硫辛酸预处理细胞后,AT1-AA诱导的H9c2细胞自噬和凋亡水平降低(P<0.05);血管紧张素Ⅱ1型受体(AT1-R)抑制剂替米沙坦预处理细胞后,AT1-AA对心肌H9c2细胞氧化应激的激活作用被抑制,自噬和凋亡水平均明显降低(P<0.05)。结论:AT1-AA通过氧化应激诱导心肌H9c2细胞的自噬及凋亡。

糖尿病诱导硫氧还蛋白相互作用蛋白(TXNIP)对小鼠胰岛β细胞衰老的影响

目的:本研究旨在观察糖尿病中硫氧还蛋白相互作用蛋白(TXNIP)的表达是否影响胰岛β细胞衰老。方法:正常小鼠(db/m)、糖尿病小鼠(db/db)随机各取6只,血糖仪检测其空腹血糖值,Western blot检测胰腺组织TXNIP蛋白表达、免疫化学染色检测胰腺组织中衰老相关β-半乳糖苷酶活性,Western blot检测胰腺组织衰老相关指标p16、p21、Rb表达的变化。INS-1胰岛β细胞随机分7组(n=6),用各组慢病毒(30μl)转染4~6 h后,嘌呤霉素(PM,3μg/m)筛选7 d,构建Normal组(正常组)、Scramble ShRNA组(干扰空病毒组)、TXNIP-ShRNA-1(TXNIP沉默一组)组、TXNIP-ShRNA-2(TXNIP沉默二组)组、TXNIP-ShRNA-3组(TXNIP沉默三组)、Ad-GFP组(过表达空病毒组)、Ad-TXNIP-GFP组(TXNIP过表达组)稳转INS-1胰岛β细胞株,检测其TXNIP蛋白表达、衰老相关β-半乳糖苷酶活性、衰老相关指标。结果:与正常小鼠相比,db/db组小鼠空腹血糖显著上升(P<0.01),胰腺组织TXNIP蛋白表达显著升高(P<0.05),胰腺组织β-半乳糖苷酶阳性染色率增加,p16、p21、Rb蛋白表达显著升高(P<0.05)。与Ad-GFP组相比,Ad-TXNIP-GFP组β-半乳糖苷酶阳性染色率增加,p16、p21、Rb蛋白表达均显著增加(P<0.01)。与Scramble ShRNA组相比,TXNIP-ShRNA组β-半乳糖苷酶阳性染色率降低,p16、p21以及Rb蛋白表达均降低(P<0.05)。结论:糖尿病可通过上调TXNIP表达,诱导胰岛β细胞衰老。

血管紧张素Ⅱ1型受体自身抗体可上调TXNIP导致大鼠胰岛β细胞系INS-1凋亡

目的血管紧张素Ⅱ1型受体(AngⅡ-1R)自身抗体能否通过影响硫氧还蛋白相互作用蛋白(TXNIP)诱导大鼠胰岛β细胞凋亡。方法体外培养大鼠胰岛β细胞系INS-1,用CCK-8试剂盒检测细胞存活率,选用10-6mol/L作为最适浓度,24 h作为最佳时间;在上述条件下,用流式细胞计量术及Western blot检测细胞凋亡及凋亡蛋白的表达;Real-time PCR和Western blot检测AngⅡ-1R自身抗体对TXNIP mRNA和蛋白表达的影响。结果AngⅡ-1R自身抗体呈浓度及时间依赖性降低INS-1细胞的活力(P<0.05);促进INS-1细胞凋亡(P<0.01);AngⅡ-1R自身抗体还可以促进TXNIP的mRNA和蛋白表达(P<0.01)。RNA干扰沉默TXNIP表达后,AngⅡ-1R自身抗体诱导的细胞凋亡减少(P<0.05);使用AngⅡ1R拮抗剂替米沙坦(TM)后,AngⅡ-1R自身抗体诱导的TXNIP上调及细胞凋亡均被抑制(P<0.05)。结论AngⅡ-1R自身抗体可以通过AT1R上调TXNIP导致胰岛β细胞凋亡,有望为AngⅡ-1R自身抗体阳性的糖尿病患者的防治提供新靶点。

两种蟾蜍EDF-1 cDNA的克隆及其生物信息学分析

蟾蜍皮肤基源的中药材（如蟾皮和蟾酥）,已长期应用于临床,主要治疗炎症、疼痛以及多种肿瘤。为分析这些蟾蜍中药材中含有的多肽类有效成分,通过菌落DNA聚合酶链式反应（colony polymerase chain reaction）对日本蟾蜍（Bufo japonicus formosus）皮肤cDNA质粒文库进行筛选,克隆到958 bp的转录子（GenBank accession number：KF769458）,包括5＇端13 bp、3＇端498 bp的非翻译区和447 bp的开放阅读框（open reading frame,ORF）,编码由148个氨基酸残基组成的蛋白质,与人及其他动物的内皮分化相关因子-1（endothelial differentiation-related factor-1,EDF-1）显示高度同源性。为分析中华大蟾蜍（B.gargarizans）皮肤中是否存在EDF-1的表达,在日本蟾蜍cDNA序列的基础上设计引物,并以中华大蟾蜍皮肤第一链cDNA为模板,通过PCR克隆中华大蟾蜍EDF-1 ORF。测序分析表明其ORF为447 bp（GenBank accession number：KF769459）,与日本蟾蜍的ORF长度相同,两者编码的蛋白之间存在3个氨基酸的差异,但与人源EDF-1的相似性均为95%,与其他动物的相似性介于93%-97%,表明其在进化上的高度保守性。磷酸化位点预测显示9个潜在的磷酸化位点,与已报道的该蛋白的生物学活性受上游因子的调控的研究结果相吻合。由于哺乳动物的EDF-1参与抑制内皮细胞的分化,因此它很可能是蟾蜍皮肤基源的中药材中含有的抗肿瘤的有效成分之一。

硫氧还蛋白相互作用蛋白降低GLP-1促小鼠胰岛β细胞的增殖效应

目的观察硫氧还蛋白相互作用蛋白(TXNIP)在胰高血糖素样肽-1(GLP-1)促小鼠胰岛β细胞的增殖效应中的作用。方法小鼠分为db/m组和db/db组,每组10只;慢病毒构建TXNIP过表达(Ad-TXNIP-GFP)稳转小鼠胰岛β细胞株MIN6细胞,分为对照组、Ad-GFP组和Ad-TXNIP-GFP组。Western blot检测TXNIP、增殖细胞核抗原(PCNA)和GLP-1受体(GLP-1R)的表达,HE和免疫荧光观察胰岛形态和β细胞数量,GLP-1R、Ki67,ELISA检测小鼠血清中GLP-1的表达,免疫组化检测GLP-1R水平。结果db/db鼠胰岛形态破坏且β细胞数量减少;胰腺组织PCNA表达降低(P<0.05);血清GLP-1水平降低(P<0.05);胰腺组织和胰岛GLP-1R水平降低(P<0.05);胰腺组织TXNIP表达升高(P<0.05);TXNIP过表达细胞模型构建成功(P<0.05);TXNIP过表达时GLP-1R水平降低(P<0.05);TXNIP过表达使GLP-1对胰岛β细胞的增殖效应降低(P<0.05)。结论TXNIP作用于GLP-1R从而降低GLP-1对小鼠胰岛β细胞的增殖效应。

中华大蟾蜍重组Gal-3C的原核表达、纯化及抗血清制备

半乳糖凝集素-3(galectin-3,Gal-3)与肿瘤的发生发展密切相关,已有文献表明其羧基端galectin-3C(Gal-3C)具有一定的肿瘤抑制作用。为了获得Gal-3C的抗血清,实验以已有的重组质粒pGM-Gal-3为模板,利用PCR方法扩增中华大蟾蜍Gal-3C基因片段,并将其插入到表达载体pET28b上,构建中华大蟾蜍Gal-3C的原核表达载体pET28b-Gal-3C;将构建好的重组质粒pET28b-Gal-3C转入感受态细胞E.coli BL21(DE3)中,用IPTG诱导蛋白质表达,并通过SDS-PAGE和Western-blot检测目的蛋白Gal-3C的表达;以纯化的重组蛋白Gal-3C免疫小白鼠,制备鼠抗中华大蟾蜍Gal-3C的抗血清,用Western-blot检测抗血清的特异性及其效价。结果显示成功构建了中华大蟾蜍pET28b-Gal-3C重组质粒,并诱导得到了目的蛋白的表达,而且将表达产物免疫小鼠后获得了特异性良好的抗中华大蟾蜍Gal-3C的抗血清。以上结果为抗肿瘤药物的研究和发展奠定了基础。

在课堂教学中如何引导学生主动学习

多年的教学经验使我深刻体会到,要激发学生的学习兴趣关键在于教师应具备的良好素质及建立良好的师生关系两个方面:一、教师应具备的素质1.教师的信心。信心是教师做好教育工作的一个前提,教师首先要对自己有信心,不要因为学生不听话而丧失对于自己教育能力的信心,但是我们有必要认识自己教育能力不足,才能有改进,才能增强信心。其次对学生也要有信心,我们相信没有培养不好的学生,没有哪个学生天生注定教不会,只有不会教的老师。

硫氧还蛋白相互作用蛋白上调对胰岛β细胞衰老的影响及其作用机制

目的探讨硫氧还蛋白相互作用蛋白(thioredoxin interacting protein,TXNIP)上调对胰岛β细胞衰老的影响及其可能的作用机制。方法采用慢病毒构建TXNIP过表达(Ad-TXNIP-GFP)及沉默(TXNIP-ShRNA)稳转INS-1胰岛β细胞株,Western blot检测衰老相关基因p16、p21、Rb、p38 MAPK磷酸化及p53蛋白表达水平。分别采用p38MAPK抑制剂SB203580、p53抑制剂Pifithrin-β预处理细胞后,Western blot检测上述蛋白的表达水平。结果TXNIP过表达可促进p21、p16、Rb、p53蛋白表达、p38 MAPK的磷酸化(P<0.01)及INS-1细胞衰老,TXNIP沉默可抑制p21、p16、Rb、p53蛋白表达、p38 MAPK的磷酸化(P<0.05)及INS-1细胞衰老;p38 MAPK和p53抑制剂均可抑制p21、Rb蛋白的表达(P<0.05),减轻细胞衰老;p38 MAPK抑制剂可抑制p53蛋白表达(P<0.05),而p53抑制剂并不影响p38 MAPK的磷酸化及p16蛋白的表达(P>0.05)。结论TXNIP可促进p38 MAPK磷酸化以及后续p16、p53蛋白表达上调,进而增加p21、Rb蛋白表达,从而引起INS-1细胞衰老。