草甘膦单克隆抗体的制备及酶联免疫分析方法的建立

目的制备出草甘膦(glyphosate,GLY)单克隆抗体,建立间接竞争酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)快速检测茶叶中GLY的方法。方法首先合成GLY完全抗原(包被原和免疫原),通过免疫小鼠成功制备出GLY单克隆抗体。根据ELISA的检测流程,采用棋盘法确定最佳包被抗原和抗体的稀释倍数,确定最佳包被的温度和时间,并确定最佳加入一抗、二抗后反应时间,建立检测方法并对其性能进行评价。结果GLY包被抗原和抗体的稀释倍数为1:2000,包被温度为37℃、包被时间为90 min,加入一抗、二抗后反应时间为60 min。该方法的线性方程为Y=-0.2353X+0.6539(r2=0.9871),半抑制浓度(50%inhibiting concentration,IC50)为4.508 ng/mL,检出限为1.18 ng/mL。变异系数均在10%以下,与异菌脲、多菌灵、三唑磷、甲基对硫磷、噻菌灵这5种标准品的交叉反应率均低于0.03%,在茶叶中加标回收率为90.86%~110.35%,且相对标准偏差均小于10%。结论该方法具有较高的灵敏度和特异性,可用于茶叶样本中GLY残留的快速检测。

草甘膦胶体金免疫层析试纸条的研制

基于竞争抑制免疫层析原理,开展茶叶中草甘膦快速检测试纸条的研制。采用柠檬酸三钠还原氯金酸制备了20 nm胶体金颗粒,然后以胶体金为标记物制备草甘膦单克隆抗体-胶体金偶联物,以硝酸纤维素膜为固相载体,包被草甘膦半抗原-卵清蛋白偶联物为检测线、羊抗兔二抗为质控线,建立草甘膦的胶体金快速检测试纸条。同时优化了胶体金最适pH值、抗体最佳使用量、试纸条材料的型号,最终确定胶体金溶液的pH值为7.5,最佳抗体使用量为3.0 μL,硝酸纤维素膜(NC膜)的型号为CN140,胶体金结合垫(金标垫)的型号为GL-b01,样品垫的型号为GS12。通过该方法得到的试纸条对茶叶中草甘膦的检测限为0.50 mg/kg,满足国家标准对茶叶中草甘膦最大残留限量的要求,且对异菌脲、多菌灵、三唑磷、甲基对硫磷、噻菌灵均未产生交叉反应,特异性良好。该方法操作简便,检测时间仅10 min,重复性高、稳定性好,适用于茶叶中草甘膦残留的现场筛查和检测。