基于CA杂合启动子基因敲入载体的构建

目的:改造原有的Rosa26基因敲入系统,引入启动能力更强的CA杂合启动子(由鸡actin启动子和SV40增强子融合而成)。方法:运用PCR,限制性内切酶酶切及T4连接酶连接的方法,构建带有CA启动子的基因敲入载体。结果:成功地对原有Rosa26基因敲入系统进行了改造,引入了CA启动子,并且成功构建了mGluR5基因敲入载体。结论:基于CA杂合启动子的基因敲入载体具有更强的启动能力,而且能够在某些特定组织中增强目的基因的表达,为今后研究基因功能及疾病模型小鼠的制备奠定了良好基础。

Orai2蛋白的表达纯化与多克隆抗体制备及初步应用

目的:原核表达跨膜蛋白Orai2的GST融合蛋白,获得高敏感性、高特异性的兔抗Orai2多克隆抗体,用于Orai2条件性基因敲除小鼠鉴定及Orai2蛋白功能研究。方法:PCR扩增Orai2 CDS编码序列,亚克隆到编码GST的pGEX-6p-1原核表达载体上,将编码Orai2的pGEX-6p-1-Orai2重组质粒化学转化BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导GST-Orai2融合蛋白表达,经固化的谷胱苷肽琼脂糖珠亲和纯化,透析浓缩,获得用于免疫的高纯度GST-Orai2融合蛋白。SDS-PAGE鉴定后,将纯化的融合蛋白辅以弗氏佐剂,按常规方法免疫新西兰大白兔以制备多克隆抗体。Western blot检测抗体效价和特异性,并进行Orai2条件性基因敲除小鼠和同窝野生型小鼠脑组织鉴定。结果:经亲和纯化后的GST-Orai2融合蛋白纯度较高,BCA蛋白定量检测试剂盒测定蛋白浓度约0.35 mg/ml。抗Orai2多抗抗体效价达1∶10 000。能特异性识别转染真核细胞获得的过表达Orai2,以及小鼠脑组织内源性的Orai2蛋白,而不与Orai1发生交叉反应。同时,用自制的Orai2多克隆抗体检测发现,与同窝野生型小鼠相比,Orai2条件性基因敲除小鼠脑组织中Orai2蛋白表达明显降低。结论:成功表达并纯化了GST-Orai2融合蛋白,获得了高敏感度、特异性的抗Orai2蛋白的多克隆抗体,该抗Orai2多抗能特异性识别过表达的和小鼠脑组织内源性Orai2蛋白,能对Orai2条件性基因敲除小鼠和同窝野生型小鼠脑组织进行鉴定,且与Orai1没有交叉反应,为进一步研究Orai2功能奠定了基础。

LanCL1融合蛋白表达纯化及其多克隆抗体制备鉴定

目的:获得LanCL1原核和真核表达融合蛋白,制备兔抗LanCL1的多克隆抗体以用于LanCL1基因功能研究。方法:PCR扩增LanCL1 CDS编码区序列,分别亚克隆至原核和真核表达载体上。将真核表达重组质粒用脂质体转染HEK293细胞成功获得了pRK5-LanCL1真核表达融合蛋白。同时将原核表达重组质粒化学转化BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导GST-LanCL1原核表达融合蛋白,谷胱甘肽琼脂糖珠亲和纯化,透析浓缩获得高纯度GST-LanCL1融合蛋白。将纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并用Western Blot检测抗体。结果:获得了LanCL1真核和原核表达重组融合蛋白。经亲和纯化后的GST-LanCL1融合蛋白纯度达到90%,BCA蛋白定量浓度约0.44mg/mL。获得了高效价的特异性兔抗LanCL1多克隆抗体。结论:成功进行了LanCL1融合蛋白的原核和真核表达,并获得抗LanCL1的高灵敏度的多克隆抗体,为LanCL1进一步功能研究奠定了基础。

用基于galK的同源重组的方法构建arc基因表达增强的载体

目的:利用同源重组的方法,将arcBAC(bacteria artificial chromosome)启动子区域的SRE(serumre-sponse element)改造成Gal4结合序列,以此通过Gal4/UAS系统增强arc基因表达。方法:在大肠杆菌中利用依赖于噬菌体基因的同源重组,通过galK正负筛选的方法改造arcBAC。结果:成功将arc启动子区域的SRE改造成Gal4结合序列,并且没有影响arc基因的其他序列。结论:成功改造BAC,可以将此BAC用在Gal4/UAS系统增强arc基因表达的实验中。

用重组工程技术快速构建Shank3条件性敲除载体

目的:构建Shank3条件性敲除载体,最终用于构建Shank3条件性敲除小鼠。方法:用重组工程技术来快速高效地构建条件敲除载体。结果:成功构建得到Shank3条件性敲除载体。结论:重组工程技术是一个用于构建条件性敲除载体成熟而高效的方法。