鸡组织滴虫病的病理学诊断

本研究通过疾病的调查、肉眼病变和组织病理学观察的方法,对扬州大学动物医院收集送检病鸡进行了病理学诊断。病鸡临床症状表现为精神萎靡,鸡冠发紫,排出淡绿色稀粪;剖检病鸡可观察到肝脏肿大,表明有大小不等的黄褐色坏死灶,盲肠肿大,内有黄色干酪样栓子;显微镜下肝脏和盲肠中有嗜伊红的组织滴虫虫体,并有大量嗜酸性粒细胞存在。经临床症状观察、病理剖检以及病理组织学诊断,确诊为鸡组织滴虫病。

猪食欲肽受体2激动剂细胞筛选模型的建立及对天然中药提取物受体激动剂的筛选

本研究旨在构建猪食欲肽受体2(pOX2R)的真核表达载体,探究其对天然中药提取物的药理学活性。将成功构建的pcDNA3.1(+)-myc/pOX2R和报告质粒PGL4.29[luc2p/CRE/Hygro]分别瞬时转染HEK293T细胞,利用萤火虫荧光素酶报告基因检测法测定阳性细胞株在不同浓度激动剂Orexin A和Orexin B以及颉颃剂TCS作用下胞内cAMP水平。将目的质粒与报告质粒稳定共转染CHO-K1细胞,利用G418和潮霉素B进行抗性筛选,获得6株阳性细胞株和5株阴性细胞株。对具有促进食欲作用的18种天然中药材的36种提取物进行筛选,并用瞬时共转染了pcDNA3.1(+)-myc/pOX2R和PGL4.29[luc2p/CRE/Hygro]的HEK293T细胞作为研究对象,对阳性提取物进行剂量效应分析。结果显示,Orexin A与Orexin B单独作用细胞时,可以使萤火虫荧光素酶的活性提高,呈明显的剂量效应关系,当与颉颃剂TCS联合作用时,TCS可以颉颃激动剂对受体的激活作用。通过优化药物刺激时间和二甲亚砜(DMSO)用量后,建立了以pOX2R为靶点的稳定、可靠的激动剂细胞筛选模型。经过初筛和复筛,得到了甘草水提物、白莲子和山药醇提物3种可以使阳性细胞荧光素酶表达量升高的提取物。提取物在一定浓度范围内可以刺激胞内荧光素酶的表达,呈剂量效应关系。以上结果为筛选出可以提高猪生产效率的先导化合物及相关药物研究提供参考依据。

鸡、鸭、鹅MC5R真核表达载体及突变型的构建及信号通路初探

试验旨在构建鸡、鸭、鹅黑素皮质素受体5(Melanocortin Receptor-5,MC5R)及其突变体的真核表达载体,并比较野生型与突变体MC5R在人源胚胎肾细胞(HEK293T)中的表达及功能的差异。从三种家禽血液中分别提取全基因组DNA,以其为模板,用聚合酶链式反应(PCR)扩增目的基因编码区。用同源重组方法将扩增的目的基因片段定向插入表达载体pcDNA3.1(+)中。单点突变构建pcDNA3.1(+)-MC5Rs突变型。用脂质体法将三种禽类野生型和突变型重组质粒pcDNA3.1(+)-MC5Rs分别瞬时转染入HEK293T细胞中,用双萤光素酶报告基因法检测胞内第二信使cAMP水平的变化来反应受体的表达和激活情况。结果表明:成功构建了鸡、鸭、鹅MC5R真核表达载体与各3个突变型(D119A、F254A和H257A)。在HEK293T细胞中表达时,与野生型相比,F254A的基础活性大幅升高,D119A与H257A的基础活性变化不大;D119A与H257A对激动剂α-MSH的反应活性完全丧失,F254A对于激动剂α-MSH的反应活性降低,为进一步研究体外鸡、鸭、鹅MC5R功能奠定基础。

猪食欲肽2受体突变体真核表达载体的构建及其对cAMP信号通路的影响

试验旨在构建猪食欲肽2受体(porcine orexin 2receptor,pOX2R)突变体的真核表达载体,探究其野生型与突变体的基础药理学活性差异。以pcDNA3.1(+)-myc/pOX2R野生型质粒为模板,设计特异性引物单点突变构建4种突变体:pcDNA3.1(+)-myc/pOX2R-P10S、pcDNA3.1(+)-myc/pOX2R-P11T、pcDNA3.1(+)-myc/pOX2R-V308I和pcDNA3.1(+)-myc/pOX2R-T401I,将pcDNA3.1(+)-myc/pOX2R野生型和4种突变体分别瞬时转染HEK293T细胞,利用双荧光素酶报告基因检测法测定pOX2R野生型及突变体的基础活性,并检测不同浓度激动剂作用下细胞内cAMP水平,随后用内源性激动剂食欲肽A(OXA)及食欲肽B(OXB)分别对野生型及突变体进行刺激。结果显示,4个突变体构建成功,pOX2R的第10、11、308和401位氨基酸分别突变为丝氨酸、苏氨酸、异亮氨酸和缬氨酸。将pOX2R的野生型及4个突变体瞬时转染HEK293T细胞后,野生型与突变体的基础活性值无显著差异(P>0.05),表明这4个位点的氨基酸突变对其受体的基础表达信号无显著影响。与野生型受体相比,突变型受体对激动剂OXB的响应无显著差异(P>0.05),而突变体P10S、P11T和T401I对激动剂OXA的响应EC50显著降低(P<0.05),其Rmax无显著差异(P>0.05)。推测第10、11和401位点的氨基酸突变可能影响了激动剂OXA与受体的结合,降低了激动剂的激动效应。本研究结果为进一步体外研究pOX2R的功能奠定了基础。

A型流感病毒NS1蛋白的研究进展

NS1蛋白不存在于病毒粒子中,但在感染A型流感病毒的细胞中表达量很高,因此,人们普遍认为NS1蛋白是A型流感病毒的非结构蛋白。NS1蛋白是一种相对较小的多肽,在抗病毒作用中能够选择性地增强病毒mRNA的翻译,并且可以调节病毒RNA的合成;在流感病毒感染的先天性免疫应答中,NS1是主要的病毒拮抗剂,通过在IFN系统中阻止关键因子的激活发挥作用;在调整PI3K信号通路中NS1通过显著性的影响总体的基因表达来破坏宿主细胞的内环境稳定,从而影响细胞凋亡。因此,NS1蛋白在克服机体阻挡病毒感染的第一道防线中的作用至关重要,是影响流感病毒致病机理和适应宿主的一个重要毒力因子。本文对NS1蛋白的结构及功能进行了概述。