牛樟芝免疫调节蛋白的过量表达及活性分析

【目的】用大肠杆菌高效表达牛樟芝免疫调节蛋白(Antrodia camphorata immunomodulatory protein,ACA)。【方法】借助DNAworks3.2.4设计引物合成大肠杆菌密码子偏好性的ACA基因,构建于pET-32a和pGEX-4t-2,转化大肠杆菌,测序后分别命名为pET-32a-ACA/BL21和pGEX-4t-2-ACA/BL21;探索密码子偏好性、载体、培养基种类和诱导条件对ACA表达的影响并使用响应面法优化蛋白表达。纯化重组ACA(recombinant ACA,rACA)并干预小鼠巨噬细胞RAW264.7,通过测定rACA对巨噬细胞增殖能力、吞噬能力、细胞形态及产NO、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNFα)、白介素lβ(interleukin-1β,IL-1β)等细胞因子能力的影响来评估rACA的活性。【结果】pET-32a-ACA/BL21更适合ACA表达;在优化的SOB(酵母粉8.92 g/L)中培养pET-32a-ACA/BL21,添加0.42 mmol/L IPTG 25℃诱导7 h时rACA以可溶性表达为主,产量达187.122μg/mL,是目前大肠杆菌表达真菌免疫调节蛋白的最高报道。纯化的rACA能显著促进小鼠巨噬细胞增殖、提高细胞的吞噬活性和改变细胞形态,显著诱导巨噬细胞分泌NO、TNF-α和IL-1β。【结论】rACA的高效可溶性表达及类似天然ACA的活性使它可以替代天然ACA作为制药行业的食品添加剂或者免疫调节剂,甚至可以用于药物研究。