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应用Red重组工程技术建立asd基因缺失的大肠杆菌DH10B菌株 被引量:6
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作者 崔文禹 李山虎 +3 位作者 姜飞 吴洋 项勇 周建光 《生物技术通讯》 CAS 2006年第4期493-495,共3页
目的:建立一株新遗传表型的大肠杆菌DH10BΔasd菌株。方法:应用pKD46介导的重组系统、kan/kil选择反选择系统、双链线性DNA重组技术和重叠引物介导的DNA重组技术,在菌株DH10B体内,对其染色体上的asd基因进行了基因敲除。结果:建立了一... 目的:建立一株新遗传表型的大肠杆菌DH10BΔasd菌株。方法:应用pKD46介导的重组系统、kan/kil选择反选择系统、双链线性DNA重组技术和重叠引物介导的DNA重组技术,在菌株DH10B体内,对其染色体上的asd基因进行了基因敲除。结果:建立了一株二氨基庚二酸(DAP)营养缺陷型重组大肠杆菌DH10BΔasd。结论:为进一步建立以大肠杆菌DH10B为载体的DNA疫苗或基因治疗载体奠定了基础。 展开更多
关键词 重组质粒 重组工程 同源重组
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维生素E琥珀酸聚乙二醇酯在紫杉醇聚酸酐微球中的应用研究 被引量:1
2
作者 赵亮 崔文禹 王永峰 《中国药师》 CAS 2007年第5期433-435,共3页
目的:研究维生素E琥珀酸聚乙二醇酯(Vit E TPGS)作为一种新型乳化剂在聚酸酐紫杉醇微球中的应用,以提高微球质量。方法:以熔解浓缩聚合法制备聚[1,3-双(对羧基苯氧基)丙烷-癸二酸],利用Vit E TPGS和聚乙烯醇(PVA)分别作乳化剂,通过单乳... 目的:研究维生素E琥珀酸聚乙二醇酯(Vit E TPGS)作为一种新型乳化剂在聚酸酐紫杉醇微球中的应用,以提高微球质量。方法:以熔解浓缩聚合法制备聚[1,3-双(对羧基苯氧基)丙烷-癸二酸],利用Vit E TPGS和聚乙烯醇(PVA)分别作乳化剂,通过单乳化方法制备紫杉醇微球。结果:Vit E TPGS作为微球乳化剂的用量只有0.1%,低于传统乳化剂PVA的10%,载药量和包封产率提高到8.51%,89.1%,在体外释药实验中,无明显突释现象,累积释药率达到85%。结论:相比于传统的乳化剂PVA,无论是在微球的制备还是在药物的包封产率上,Vit E TPGS都是一种更加有效安全的乳化剂。 展开更多
关键词 维生素E琥珀酸聚乙二醇酯 聚酸酐 乳化剂 聚[1 3-双(对羧基苯氧基)丙烷-癸二酸]
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抗TNF-α单链抗体的表达及其纯化 被引量:2
3
作者 凌媛 徐静 +3 位作者 许丽锋 崔文禹 李媛媛 李树香 《微生物学免疫学进展》 2009年第3期24-28,共5页
克隆抗人肿瘤坏死因子(TNF-α)鼠源单抗的可变区基因以构建其单链抗体(ScFv)表达载体,实现在大肠杆菌的表达,并进行ScFv的可溶性纯化与鉴定。采用RT-PCR技术,以前导肽序列的引物从1个分泌抗人TNF-α的鼠单抗杂交瘤细胞系中克隆抗体轻链... 克隆抗人肿瘤坏死因子(TNF-α)鼠源单抗的可变区基因以构建其单链抗体(ScFv)表达载体,实现在大肠杆菌的表达,并进行ScFv的可溶性纯化与鉴定。采用RT-PCR技术,以前导肽序列的引物从1个分泌抗人TNF-α的鼠单抗杂交瘤细胞系中克隆抗体轻链、重链可变区基因(VL,VH),构建ScFv基因,将ScFv基因片段与pGEX-4T-1表达载体连接,在大肠杆菌中表达并采用十二烷基肌氨酸钠(Sarkosyl)进行可溶性纯化,最后鉴定其生物活性。结果显示,得到了功能性重排的轻、重链可变区基因,分别构建了VH和VL不同连接顺序的HLL(VH-Linker-VL)和LLH(VL-Linker-VH)两种ScFv,LLH的表达量较HLL的高,但亲和力不及HLL。采用Sarkosyl溶解包涵体,对目的蛋白进行可溶性纯化,蛋白纯度达到90%,纯化后的蛋白经ELISA和WB证明ScFv维持了亲本抗体与TNF-α特异性结合的能力,且具有细胞毒中和活性。实验中研究探索了一种新颖的,操作简单,省时的裂解、纯化方案,实现了单链抗体经原核系统的表达后得以可溶性纯化。 展开更多
关键词 TNF-Α 单链抗体 纯化
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冠状病毒疫苗的研究进展
4
作者 崔文禹 徐静 《微生物与感染》 2020年第4期199-205,共7页
严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)自被发现以来就引起了人们的广泛关注,开发针对该病毒的安全、有效疫苗成为近期的研究热点。本文以高致病性冠状病毒疫苗(包括灭活疫苗、重... 严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)自被发现以来就引起了人们的广泛关注,开发针对该病毒的安全、有效疫苗成为近期的研究热点。本文以高致病性冠状病毒疫苗(包括灭活疫苗、重组亚单位疫苗、重组病毒载体疫苗和核酸疫苗)的研究展开综述,为研制SARS-CoV-2疫苗提供参考。 展开更多
关键词 严重急性呼吸综合征冠状病毒2 冠状病毒 疫苗
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抗肠道病毒71型单克隆抗体的制备及鉴定 被引量:5
5
作者 崔文禹 徐静 +5 位作者 李树香 刘敬 王欣怡 赵玉秀 陈蕾 沈心亮 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2009年第12期1210-1212,共3页
目的制备肠道病毒71型(EV71)单克隆抗体,并进行初步鉴定。方法将RD细胞和Vero细胞培养的EV71原液通过氯化铯超速离心纯化,分别作为免疫抗原和检测抗原,制备单克隆抗体。通过Westernblot分析、间接免疫荧光试验和ELISA法鉴定单抗的特异... 目的制备肠道病毒71型(EV71)单克隆抗体,并进行初步鉴定。方法将RD细胞和Vero细胞培养的EV71原液通过氯化铯超速离心纯化,分别作为免疫抗原和检测抗原,制备单克隆抗体。通过Westernblot分析、间接免疫荧光试验和ELISA法鉴定单抗的特异性。采用间接ELISA法测定单抗的酶标效价,微量细胞培养中和试验测定单抗的中和效价。结果获得1株可稳定分泌抗EV71单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其分泌的单抗可与EV71特异性结合,酶标效价为1∶204800,中和效价为1∶28。结论已成功筛选出1株分泌抗EV71的单抗细胞株,为建立EV71疫苗抗原含量测定方法奠定了基础。 展开更多
关键词 肠道病毒71型 单克隆抗体 制备 鉴定
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抗人肿瘤坏死因子-α人源单克隆抗体在CHO细胞中的表达及鉴定 被引量:4
6
作者 崔文禹 李计来 +5 位作者 凌媛 李树香 刘敬 王欣怡 徐静 张云涛 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2014年第12期1547-1550,共4页
目的在CHO细胞中表达抗人肿瘤坏死因子(human tumor necrosis factor-alpha,h TNF-α)人源单克隆抗体,并对抗体纯化后进行鉴定。方法将含有编码抗h TNF-α人源单克隆抗体轻、重链可变区及恒定区基因的真核表达质粒p HL,利用脂质体Lipofe... 目的在CHO细胞中表达抗人肿瘤坏死因子(human tumor necrosis factor-alpha,h TNF-α)人源单克隆抗体,并对抗体纯化后进行鉴定。方法将含有编码抗h TNF-α人源单克隆抗体轻、重链可变区及恒定区基因的真核表达质粒p HL,利用脂质体Lipofectamine TM 2000转染CHODG44细胞,经氨甲喋呤(methotrexate,MTX)加压筛选和单克隆筛选,获得分泌表达抗h TNF-α人源单克隆抗体的CHO细胞株。应用Mab Select Su Re和Capto adhere两步层析纯化抗体后,分析抗体的纯度、N-末端序列、结合动力学平衡常数及中和活性。结果经两步层析后,抗h TNF-α人源单抗经SDS-PAGE分析,可见纯度较好的抗体重链、轻链和完整抗体条带,SEC-HPLC纯度为98.79%;抗体的轻、重链N-末端氨基酸序列与预期一致,其结合动力学平衡常数(KD)为1.34×10-10 M,能拮抗TNF-α对L929细胞的杀伤作用,对TNF-α细胞毒的中和率达90%左右。结论在CHO细胞中成功表达了具有较好中和活性的抗h TNF-α人源单克隆抗体。 展开更多
关键词 肿瘤坏死因子-Α 单克隆抗体 CHO细胞
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大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位的原核表达、纯化及其黏膜免疫佐剂作用 被引量:1
7
作者 崔文禹 李媛媛 +3 位作者 单璞 凌媛 李计来 徐静 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2011年第12期1417-1420,共4页
目的原核表达、纯化大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(Heat-labile enterotoxin B subunit,LTB),并评价其黏膜免疫的佐剂作用。方法从产毒素大肠杆菌44815菌株中扩增出LTB基因,克隆至质粒pET-32a(+)中,构建重组原核表达质粒pET-32a(+)-LTB,... 目的原核表达、纯化大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(Heat-labile enterotoxin B subunit,LTB),并评价其黏膜免疫的佐剂作用。方法从产毒素大肠杆菌44815菌株中扩增出LTB基因,克隆至质粒pET-32a(+)中,构建重组原核表达质粒pET-32a(+)-LTB,转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,IPTG诱导表达,表达的LTB经纯化后进行神经节苷脂GM1结合活性及黏膜免疫佐剂活性鉴定。结果重组表达质粒经双酶切及测序鉴定证明构建正确;重组LTB主要为可溶性表达,表达量约占菌体总蛋白的15%;纯化的LTB纯度可达95%以上,可与兔抗CTB血清发生特异性反应,且具有GM1结合活性及良好的黏膜免疫佐剂活性。结论在大肠杆菌中成功表达了重组LTB蛋白,纯化的LTB具有良好的黏膜免疫佐剂活性。 展开更多
关键词 大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位 免疫 黏膜 佐剂 免疫
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新型BCR-ABL激酶抑制剂的研究进展 被引量:1
8
作者 崔文禹 赵若熙 +3 位作者 韩路路 倪伟伟 李飞 韩进松 《药学学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第2期258-273,共16页
融合基因BCR-ABL在人体内表达的蛋白质是一种异常的酪氨酸激酶,可导致慢性髓系白血病(chronic myeloid leukemia,CML)。随着对CML发病机制的进一步研究,人们发现开发选择性抑制异常BCR-ABL酪氨酸激酶的化合物是值得关注的研究方向。前三... 融合基因BCR-ABL在人体内表达的蛋白质是一种异常的酪氨酸激酶,可导致慢性髓系白血病(chronic myeloid leukemia,CML)。随着对CML发病机制的进一步研究,人们发现开发选择性抑制异常BCR-ABL酪氨酸激酶的化合物是值得关注的研究方向。前三代BCR-ABL抑制剂为正构抑制剂,该抑制剂竞争性阻断ABL蛋白酪氨酸激酶与ATP的结合,阻止其激活下游信号。第四代BCR-ABL抑制剂通过与肉豆蔻酰口袋结合,变构抑制ABL蛋白酪氨酸激酶,具有更强的选择性且保持对耐药性突变蛋白的活性。蛋白水解靶向嵌合(proteolytic targeting chimera,PROTAC)、共价抑制剂和双重靶向抑制剂等新型药物设计策略也为BCR-ABL激酶抑制剂的开发提供了新的方向。本文综述了近年来有关BCR-ABL激酶抑制剂的研究进展,并讨论了各种新型BCR-ABL抑制剂的药物设计策略。 展开更多
关键词 慢性髓系白血病 BCR-ABL 抑制剂 药物设计策略
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乙型肝炎病毒核心抗原的原核表达及纯化 被引量:2
9
作者 李计来 徐静 +4 位作者 王娟 吴刚 崔文禹 赵莉 许丽锋 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2011年第10期1121-1125,共5页
目的原核表达乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg),纯化HBcAg病毒样颗粒(Virus-like particle,VLP),并对其理化性质进行鉴定。方法根据大肠杆菌密码子偏爱性对HBcAg基因进行密码子优化,全基因合成优化基因,克隆至载体pET-32a(+)中,构建原核表... 目的原核表达乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg),纯化HBcAg病毒样颗粒(Virus-like particle,VLP),并对其理化性质进行鉴定。方法根据大肠杆菌密码子偏爱性对HBcAg基因进行密码子优化,全基因合成优化基因,克隆至载体pET-32a(+)中,构建原核表达质粒pET-HBcAg,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。重组蛋白经盐析和层析纯化后,经SDS-PAGE、Western blot、电镜观察、等电点分析、高效液相色谱(HPLC)分析和N-末端氨基酸测序等进行鉴定。结果重组表达质粒经酶切和测序鉴定证明构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为21 000,为可溶性表达,表达量占菌体总蛋白的21.6%;纯化后其纯度可达99.4%,具有良好的反应原性,VLP形成良好,结构均一,等电点在pH 6.0~6.9之间,HPLC分析形成T3和T4两种不同结构,N-末端序列正确,无氨基酸降解。结论已成功构建了HBcAg原核表达质粒,并获得了高纯度的HBcAgVLP,为进一步研究HBcAg VLP的生物学特性奠定了基础。 展开更多
关键词 肝炎核心抗原 乙型 病毒样颗粒 基因优化 原核细胞 基因表达 纯化
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肠道病毒71型抗原含量检测方法的建立及初步验证 被引量:1
10
作者 徐静 崔文禹 +4 位作者 李树香 刘敬 王欣怡 陈蕾 沈心亮 《中华实验和临床病毒学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第5期388-390,共3页
目的建立肠道病毒71型(EV71)抗原含量检测方法并进行初步验证,用于疫苗研制及生产过程中抗原含量的检测。方法以抗EV71单克隆抗体为包被抗体,酶标抗EV71多克隆抗体为检测抗体,建立双抗体夹心ELISA方法,以本室自制EV71抗原参考品... 目的建立肠道病毒71型(EV71)抗原含量检测方法并进行初步验证,用于疫苗研制及生产过程中抗原含量的检测。方法以抗EV71单克隆抗体为包被抗体,酶标抗EV71多克隆抗体为检测抗体,建立双抗体夹心ELISA方法,以本室自制EV71抗原参考品为定量标准,建立抗原标准曲线,确定定量限度及最佳定量范围,并对该方法的准确度、精密度和特异性进行初步验证。结果建立了双抗体夹心检测EV71抗原含量的ELISA方法,定量限度为0.23μg/ml,最佳定量范围为7.32~0.23μg/ml,相关系数为R^2=0.9976;准确性较好,回收率在90%~110%之间;精密性较好,变异系数小于10%;除与EV71样品有特异性反应外,与其他样品无交叉反应。结论建立了检测EV71抗原含量的双抗体夹心ELISA方法并进行了初步验证,为疫苗研制过程中抗原含量测定提供了简便、快捷的检测手段。 展开更多
关键词 肠道病毒属 酶联免疫吸附测定 敏感性与特异性
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呼吸道合胞病毒培养及其病毒滴度检测方法的建立 被引量:1
11
作者 王欣怡 李树香 +2 位作者 刘敬 崔文禹 徐静 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2015年第9期973-975,978,共4页
目的确定呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)培养条件,筛选病毒保护剂配方,并建立检测病毒滴度的微量细胞病变方法。方法分别将Hep2、Vero和293R细胞以0.01 MOI接种RSV,选择病毒培养细胞基质;将RSV分别以0.005和0.02 MO... 目的确定呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)培养条件,筛选病毒保护剂配方,并建立检测病毒滴度的微量细胞病变方法。方法分别将Hep2、Vero和293R细胞以0.01 MOI接种RSV,选择病毒培养细胞基质;将RSV分别以0.005和0.02 MOI接种Hep2细胞,在4~9 d收获病毒液,检测病毒滴度,确定最佳MOI及病毒收获时间;将6种配方病毒保护剂分别加至病毒液中,反复冻融7次,检测病毒滴度,筛选最佳配方;将病毒分别在33和37℃条件下滴定,第7、9天判定结果,确定微量细胞病变方法的培养温度和判定时间。结果确定病毒培养细胞基质为Hep2细胞,以0.02 MOI RSV接种后,37℃培养7~9 d收获病毒液;配方1(0.1%人血白蛋白)为最佳病毒保护剂配方;微量细胞病变法的实验条件为37℃滴定,7 d判定结果。结论建立了稳定可靠的呼吸道合胞病毒培养及病毒滴度检测方法。 展开更多
关键词 呼吸道合胞病毒 培养条件 病毒滴度
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抗血管内皮生长因子鼠-人嵌合抗体真核表达载体的构建及在CHO DG44细胞中的表达 被引量:3
12
作者 陈刚 李计来 +3 位作者 崔文禹 凌媛 徐静 张云涛 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2014年第11期1394-1399,共6页
目的构建抗血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)鼠-人嵌合抗体真核表达载体,并在CHO DG44细胞中进行表达及初步鉴定。方法分别采用鸡胚尿囊膜试验和小鼠肿瘤抑制试验检测鼠抗人VEGF单克隆抗体2E5对VEGF促血管生... 目的构建抗血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)鼠-人嵌合抗体真核表达载体,并在CHO DG44细胞中进行表达及初步鉴定。方法分别采用鸡胚尿囊膜试验和小鼠肿瘤抑制试验检测鼠抗人VEGF单克隆抗体2E5对VEGF促血管生成和肿瘤增生的抑制作用;采用RT-PCR法从鼠源性抗VEGF单克隆抗体的杂交瘤细胞2E5中扩增抗VEGF抗体重链可变区基因(VH)和轻链可变区基因(VL),利用IMGT数据库进行序列比对分析,筛选出功能性基因;采用重叠延伸PCR技术(gene splicing by overlap extension PCR,SOE PCR)将VH基因与人Ig G1重链恒定区基因连接,VL基因与人Ig G1轻链恒定区基因连接,分别构建嵌合抗体重链基因和轻链基因,将嵌合的重链基因连入p Opti VECTM-TOPO誖TA载体,轻链基因连入pc DNATM3.3-TOPO誖TA载体,构建重链表达质粒p Opti VEC-H和轻链表达质粒pc DNA 3.3-L;采用脂质体法将重链和轻链表达质粒共转染CHO DG44细胞,经缺陷性培养基筛选和抗性标记筛选、MTX加压后,利用有限稀释法挑选单细胞株,ELISA法检测嵌合抗体的表达量;取批次培养的嵌合抗体细胞株上清液,经Mab Select Sure亲和纯化和陶瓷羟基磷灰石纯化后,对纯化的嵌合抗体进行SDS-PAGE和高效液相色谱分析,并测定N-端序列、分子量和解离常数。结果鼠抗人VEGF单克隆抗体2E5能抑制VEGF的促血管生成和肿瘤生长。嵌合表达载体p Opti VEC-H和pc DNA 3.3-L经菌落PCR及测序证实构建正确。经缺陷性培养基筛选、抗性标记筛选、MTX加压及单克隆筛选后,嵌合抗体的表达量可达68.5μg/ml。纯化的嵌合抗体纯度达99%以上;N-端测序结果与预期重、轻链N-端氨基酸序列一致;质谱法测定分子量为149 290;解离常数为2×10-9 mol/L。结论成功构建了抗VEGF鼠-人嵌合抗体轻、重链表达载体,在CHO DG44细胞中表达了嵌合抗体,经层析纯化的嵌合抗体纯度较高,与VEGF抗原具有较强的亲和力,为后续进行抗VEGF单克隆抗体的人源化改造奠定了基础。 展开更多
关键词 血管内皮生长因子 嵌合抗体 CHO细胞 纯化
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二硫键稳定的抗TNF-α单链抗体的原核表达及生物学特性鉴定
13
作者 凌媛 徐静 +3 位作者 许丽锋 崔文禹 李媛媛 李树香 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2009年第8期753-757,共5页
目的构建二硫键稳定的抗TNF-α单链抗体原核表达质粒,并进行表达和生物学特性鉴定。方法利用SWISS-PROT软件分析抗TNF-α单链抗体(scFv)的结构,并结合二硫键稳定的单链抗体(ds-scFv)的突变位点设计原则,确定其突变位点,采用PCR定点突变... 目的构建二硫键稳定的抗TNF-α单链抗体原核表达质粒,并进行表达和生物学特性鉴定。方法利用SWISS-PROT软件分析抗TNF-α单链抗体(scFv)的结构,并结合二硫键稳定的单链抗体(ds-scFv)的突变位点设计原则,确定其突变位点,采用PCR定点突变的方法,构建二硫键稳定的抗TNF-α单链抗体的表达质粒pGEX-4T-1-ds-scFv,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。采用十二烷基肌氨酸钠(Sarkosy)l对表达的目的蛋白进行可溶性纯化,并进行抗原结合活性、相对稳定性及细胞毒中和活性检测。结果重组表达质粒pGEX-4T-1-ds-scFv经菌落PCR及测序鉴定,证明构建正确。抗TNF-α的ds-scFv的表达量占菌体总蛋白的16.6%,主要以包涵体形式表达;纯化的目的蛋白纯度可达94.4%;经ELISA及Western blot验证,ds-scFv与TNF-α抗原的结合活性与scFv相近;相对稳定性优于scFv;在同样的抗体浓度下,scFv和ds-scFv的细胞毒中和活性略低于亲本鼠单抗,ds-scFv略高于scFv。结论已成功构建了二硫键稳定的抗TNF-α单链抗体的原核表达质粒,并获得有活性的目的蛋白,为进一步研究其生物学功能奠定了基础。 展开更多
关键词 肿瘤坏死因子-Α 二硫键稳定的单链抗体 原核表达 生物学特性
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重组水痘-带状疱疹病毒gEΔ-Fc融合蛋白在CHO细胞中的表达、鉴定及免疫原性分析 被引量:3
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作者 崔文禹 李计来 +2 位作者 张转 侯一波 徐静 《中华微生物学和免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2020年第9期709-713,共5页
目的应用CHO细胞表达系统表达重组水痘-带状疱疹病毒(varicella-zoster virus,VZV)gEΔ-Fc融合蛋白,为筛选重组带状疱疹疫苗候选抗原提供参考。方法将含有编码gEΔ-Fc基因的真核表达质粒转染CHO细胞,经MSX加压筛选和有限稀释法挑选单克... 目的应用CHO细胞表达系统表达重组水痘-带状疱疹病毒(varicella-zoster virus,VZV)gEΔ-Fc融合蛋白,为筛选重组带状疱疹疫苗候选抗原提供参考。方法将含有编码gEΔ-Fc基因的真核表达质粒转染CHO细胞,经MSX加压筛选和有限稀释法挑选单克隆,获得分泌表达gEΔ-Fc融合蛋白的CHO细胞株。MabSelect SuRe亲和层析纯化gEΔ-Fc融合蛋白,ELISA法对gEΔ-Fc融合蛋白与Fc受体结合进行鉴定,流式细胞术检测DC2.4细胞对抗原的吞噬效果。gEΔ-Fc融合蛋白免疫BALB/c小鼠后,ELISA法检测小鼠血清抗体效价。结果获得表达gEΔ-Fc融合蛋白的CHO细胞株;流式细胞术证明DC2.4细胞对gEΔ-Fc融合蛋白的吞噬强于gE;gEΔ-Fc融合蛋白可以诱导BALB/c小鼠产生高滴度的抗VZV抗体。结论应用CHO细胞表达的重组VZV gEΔ-Fc融合蛋白具有较好的免疫原性。本研究为筛选重组带状疱疹疫苗候选抗原提供了数据支持。 展开更多
关键词 水痘-带状疱疹病毒 糖蛋白 融合蛋白 FC受体
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单磷酸脂质A(MPLA)pH敏感脂质体制备及免疫增强作用研究
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作者 崔文禹 全文静 +3 位作者 李计来 侯一波 徐静 张云涛 《中华微生物学和免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2022年第9期699-704,共6页
目的制备pH敏感脂质体,避免溶酶体对单磷酸脂质A(monophosphoryl lipid A,MPLA)的降解,提高MPLA的利用率。方法以DOPE、CHEMS为载体材料,采用薄膜分散法制备pH敏感脂质体。应用动态光散射仪测定脂质体的粒径及Zeta电位,透射电镜观察不... 目的制备pH敏感脂质体,避免溶酶体对单磷酸脂质A(monophosphoryl lipid A,MPLA)的降解,提高MPLA的利用率。方法以DOPE、CHEMS为载体材料,采用薄膜分散法制备pH敏感脂质体。应用动态光散射仪测定脂质体的粒径及Zeta电位,透射电镜观察不同pH值条件下pH敏感脂质体的外观形态,应用流式细胞术评价THP-1、DC2.4细胞对脂质体的吞噬效果,激光共聚焦显微镜下观察脂质体与溶酶体的共定位情况。以乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBsAg)为模式抗原,配伍MPLA pH敏感脂质体免疫BALB/c小鼠,ELISA定量检测血清乙型肝炎表面抗体(anti-HBs)水平,ELISPOT检测小鼠脾淋巴细胞IFN-γ、IL-2斑点形成细胞数(spot forming cells,SFCs)。结果制备的pH敏感脂质体的平均粒径为(90.90±1.13)nm,多分散指数(polydispersity index,PDI)为0.076±0.013,Zeta电位为(-27.900±0.666)mV,随着溶液的pH值减小粒径明显增大,呈现不规则形态,具备显著的pH敏感性。THP-1细胞吞噬pH敏感荧光脂质体的吞噬率为10.40%,DC2.4细胞的吞噬率为12.40%,吞噬荧光脂质体的吞噬率分别为1.09%和0.28%。激光共聚焦显微镜观察到pH敏感荧光脂质体被THP-1细胞吞噬后,存在于细胞质中,而荧光脂质体存在于溶酶体中,MPLA pH敏感脂质体与MPLA脂质体比较可以显著提高小鼠细胞免疫应答水平,MPLA pH敏感脂质体组的IFN-γ和IL-2 SFCs水平均显著高于MPLA脂质体组(P<0.01)和无佐剂组(P<0.001)。结论pH敏感脂质体递送系统可以提高MPLA的利用率,使MPLA更好地发挥佐剂作用。 展开更多
关键词 pH敏感脂质体 单磷酸脂质A 佐剂
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CHO DG44细胞电转染条件的优化 被引量:3
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作者 李计来 崔文禹 +2 位作者 刘敬 郝少杰 徐静 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2017年第11期1207-1210,共4页
目的优化CHO DG44细胞的电转染条件,提高细胞的转染效率。方法采用电转染的方法将p EGFP-1质粒转入CHO DG44细胞内,利用L9(33)正交试验设计,对质粒量、电压和电容3因素进行优化,流式细胞仪检测不同条件下的绿色荧光蛋白(green fluoresce... 目的优化CHO DG44细胞的电转染条件,提高细胞的转染效率。方法采用电转染的方法将p EGFP-1质粒转入CHO DG44细胞内,利用L9(33)正交试验设计,对质粒量、电压和电容3因素进行优化,流式细胞仪检测不同条件下的绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)阳性率和GFP的平均荧光强度,台盼蓝染色对细胞进行计数,了解细胞生长情况。结果 3个因素中,电压对转染效率影响最大,其次为电容,质粒浓度影响最小。质粒量8μg、电压300 V、电容900μF为最佳电转染条件。结论优化了CHO DG44细胞的电转染条件,为外源基因转染CHO DG44细胞表达重组蛋白提供了基础数据。 展开更多
关键词 电转染 CHO DG44细胞 正交试验设计 转染效率
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内部核糖体结合位点介导的三顺反子抗人肿瘤坏死因子-α单克隆抗体表达质粒的构建及在CHO细胞中的表达 被引量:1
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作者 李计来 崔文禹 +3 位作者 王欣怡 刘敬 郝少杰 徐静 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2017年第12期1252-1257,共6页
目的构建内部核糖体结合位点(internal ribosome entry site,IRES)介导的三顺反子抗人肿瘤坏死因子-α(human tumor necrosis factor-α,hTNF-α)单克隆抗体的表达质粒,并在CHO细胞中进行表达。方法采用重叠延伸PCR(gene splicing by ov... 目的构建内部核糖体结合位点(internal ribosome entry site,IRES)介导的三顺反子抗人肿瘤坏死因子-α(human tumor necrosis factor-α,hTNF-α)单克隆抗体的表达质粒,并在CHO细胞中进行表达。方法采用重叠延伸PCR(gene splicing by overlap extension PCR,SOE-PCR)技术扩增hTNF-α抗体的轻、重链基因,并与IRES基因连接,将连接产物LC-IRES-HC基因克隆至pOptiVEC^(TM)-TOPO~?TA载体,构建单表达载体pOptiVEC-LIH。将单表达载体pOptiVEC-LIH及共转染载体pOptiVEC-HC和pcDNA3.3-LC分别电转至CHODG44细胞,经氨甲喋呤(methotrexate,MTX)加压筛选稳定转染细胞,有限稀释法筛选高表达单克隆细胞株,并采用3 L反应罐对高表达株进行补料批次发酵培养。结果经测序鉴定,单表达载体pOptiVEC-LIH构建正确。瞬时转染后,单表达载体pOptiVEC-LIH转染组的抗体表达量明显高于共转染载体p Opti VEC-HC和pcDNA3.3-LC(P<0.05);经稳定转染有限稀释筛选后,共获得132个克隆,其中A值>2.0的克隆有18株,应用3 L反应器补料批次发酵培养,其表达量可达250 mg/L。结论成功构建了三顺反子抗hTNF-α单克隆抗体的表达质粒,并在CHO细胞中进行了表达。 展开更多
关键词 内部核糖体结合位点 人肿瘤坏死因子-Α 单克隆抗体 CHO细胞
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