2019—2022年聊城市食品和病例分离单增李斯特菌基于全基因组测序的分子特征及耐药性分析

目的基于全基因组测序(WGS)比较分析2019—2022年聊城市单核细胞增生李斯特菌(Lm)食品和病例分离株基因组特征、毒力性、耐药性以及遗传多样性。方法对聊城市33株市售食品和临床病例中Lm分离株开展抗生素敏感性试验和WGS。利用MGAP对WGS数据进行拼接组装,对组装基因组进行基因预测和功能注释、MLST,制作cg MLST最小生成树图,并与美国国家生物信息中心(NCBI)上获取的18株国内外Lm构建wg-SNP进化树。结果33株Lm分离株的基因组大小为2.89~3.41 Mb,CG含量为37.81%~37.97%,可分为6个ST型(ST9、ST121、ST8、ST87、ST155、ST101),分别属于6个克隆复合群(CC9、CC121、CC8、CC87、CC155、CC101);分离株均携带fosX和mprF耐药基因,此外还携带lplA1、prsA2等其他18个毒力基因,有不同程度的毒力基因缺失情况。2株菌对四环素耐药,1株菌对林可霉素耐药。均携带毒力岛LIPI-1和LIPI-2,未检测到毒力岛LIPI-3和LIPI-4。wg-SNPs、cgMLST和基于单拷贝核心蛋白序列的系统发育树遗传进化分析显示,33株Lm分子分型呈现高度多样性,病例来源菌株与食品分离株亲缘关系密切,食品分离株与国外暴发分离株在进化关系上密切相关。结论山东省聊城市食品和病例中分离的单增李斯特菌均携带毒力基因,具有一定的潜在致病能力,耐药情况尚不严重。分子型别呈现出多样性,食品来源菌株和病例分离株具有较近的亲缘关系,提示市售食品有食源性感染的潜在风险。

山东省聊城市2020-2021年小肠结肠炎耶尔森菌食品分离株分子特征分析

目的了解2020-2021年山东省聊城市小肠结肠炎耶尔森菌(Y.e)食品分离株分子特征。方法对聊城市市售生肉与肉制品中Y.e开展分离培养、药敏试验、毒力基因检测、PFGE和全基因组测序(WGS)。利用微生物基因组注释系统对全基因组数据进行拼接组装,对组装基因组开展多位点序列分型(MLST)和核心基因组多位点序列分型(cgMLST),并应用基于WGS的单核苷酸多态性(wg-SNPs)分型方法与美国生物技术信息中心上获取的14株国内外Y.e的基因组进行遗传进化分析。结果165份样品中共检出21株Y.e,检出率为12.73%,20株Y.e测序成功。Y.e携带多种耐药基因和毒力基因,出现多重耐药现象,毒力基因PCR检测显示21株Y.e呈现2种毒力基因特征;PFGE、MLST和cgMLST聚类分析显示,21株Y.e呈高度多样性;wg-SNPs遗传进化分析显示20株Y.e可分为2个进化主分支。结论聊城市生肉与肉制品中分离的Y.e携带多种耐药基因和毒力基因,且分子分型呈现高度多样性,应加强生肉与肉制品中Y.e分子生物学监测,开展基因组测序及分子分型检测工作,为预防由Y.e引起的食源性疾病提供理论依据。

聊城地区卡他莫拉菌耐药分析

目的本研究对2016年-2019年聊城市人民医院和聊城市第二人民医院呼吸道感染患者来源的卡他莫拉菌进行了耐药分析。方法按照临床实验室标本处理流程对标本进行分离培养,菌株通过VITEK MS全自动鉴定仪进行鉴定,并对卡他莫拉菌进行药物敏感性分析。结果本研究的102例卡他莫拉菌分离株绝大多数菌株(96.36%)呈现β-内酰胺酶阳性。全部菌株对氨苄西林全部呈现耐药,未发现中敏或者敏感株;但是普遍对青霉素与β-内酰胺/β-内酰胺酶联合用药(阿莫西林/克拉维甲酸)敏感,对三代头孢(头孢曲松、头孢噻肟、头孢他啶)以及喹诺酮类抗生素(环丙沙星和左氧氟沙星)敏感,对阿奇霉素和氯霉素敏感,未发现中敏或者耐药株。本研究中卡他莫拉菌对第二代头孢(头孢克洛、头孢辛夫)出现少部分耐药,对四环素和复方新诺明出现少部分耐药,对克林霉素出现大部分(55.88%)耐药。结论医院治疗卡他莫拉菌感染,阿莫西林/克拉维酸和第三代头孢类抗菌药物可作为在药敏结果未报告之前的经验首选,应及时行培养、鉴定、药敏试验,根据实际菌株的耐药情况调整用药。

家禽中艾伯特埃希菌的分离培养和鉴定

目的分析聊城市家禽中艾伯特埃希菌感染状况,为预防艾伯特埃希菌感染引起的食源性疾病提供依据。方法于2017年10月选取聊城市3个规模较大的食品公司采集鸡肠、鸭肠样品进行EC增菌肉汤培养后,采用PCR检测eae基因,阳性增菌液接种到麦康凯琼脂平板上分离纯化,随后进行生化鉴定,采用clpX、LysP和mdh管家基因对疑似菌株进一步进行三重PCR和多位点序列分型(MLST)鉴定。结果共采集样品250份,检出51株eae阳性且不发酵乳糖和木糖的艾伯特埃希菌,检出率为20.40%,全部来自于乙公司采集的新鲜鸡肠。三重PCR结果显示51株菌株的clpX、lysP和mdh均为阳性,且与艾伯特埃希菌参考菌株KF1和LMG20976高度聚集,形成独立的分支,51株菌均为艾伯特埃希菌。结论聊城市家禽中存在艾伯特埃希菌,三重PCR和MLST聚类分析对艾伯特希菌鉴定可行有效。

噬琼胶卵链菌β-琼胶酶基因YM01-5的克隆表达及其酶学性质的研究

目的从青岛近海海水中分离鉴定了1株能够降解琼胶的海洋新菌—嗜琼胶卵链菌(Catenovulumagarivorans gen.nov.sp.nov.)YM01T,并对其进行了全基因组测序。本文对该菌的1个β-琼胶酶基因YM01-5进行了克隆表达,并对重组琼胶酶的酶学性质进行了研究。方法利用镍柱亲和层析对重组琼胶酶进行了分离纯化,采用DNS法测定重组酶的酶学性质,薄层层析(TLC)和质谱(MS)法对AgaYM01-5的酶解产物进行分析。结果β-琼胶酶基因YM01-5全长2 412bp,编码803个氨基酸,预测分子量为91.6kD,其催化模块属于糖苷水解酶GH50家族。重组琼胶酶YM01-5酶学性质的研究结果表明,该酶的最适温度为40℃,最适pH为9.0。在35℃以下具有良好的热稳定性,pH 6~10之间保持较高的稳定性,在该范围的pH缓冲液中放置12h后,YM01-5仍能保持80%以上的酶活力。此外,该重组琼胶酶降解琼脂糖的Km、Vmax值分别为15.6 mg/mL和188 U/mg,对降解产物的薄层层析及质谱分析结果表明,β-琼胶酶基因YM01-5以外切酶的形式作用于琼脂糖产生新琼二糖作为终产物。结论该酶降解产物单一,有利于琼胶寡糖的制备,具有较高的工业应用潜力,它的发现也为研究菌株YM01中琼脂糖的代谢通路提供了参考。

一起肉毒梭菌中毒事件的实验室诊断

目的 对2023年11月发生的1起疑似肉毒中毒事件的相关样本进行实验室检测,对分离到的一株A型肉毒梭菌(C. botulinum)进行全基因组测序(WGS)。方法 对食品、病例粪便和环境样本应用实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)快速检测肉毒毒素基因。参照GB 4789.12—2016对样本进行前处理,经接种疱肉培养基和TPGYT培养基增菌培养5 d,通过动物试验进行毒素检出、确证和定性实验,采用卵黄琼脂平板分离和纯化菌株,并用API 20A和VITEK MS做菌种鉴定。同时对分离得到的菌株开展WGS,分析菌株的遗传特征。结果 病例粪便样本A型肉毒毒素基因阳性,通过动物试验检出A型肉毒毒素,利用卵黄琼脂平板成功分离A型肉毒梭菌RD1和RD2。其他样品均为阴性。WGS分析显示,该菌为肉毒梭菌,共有12个毒素编码相关基因,染色体上有3个噬菌体序列,wg-SNPs分析显示RD1和RD2与BrDura亲缘关系最近。结论 此次实验按照国家标准和本实验室建立的荧光定量PCR方法进行鉴定,检测方案和结果为临床A型肉毒中毒提供参考。