梅病毒A新疆蟠桃分离物的全基因组序列分析与侵染性克隆构建

【目的】梅病毒A(mume virus A,MuVA)是新发现的感染桃树的病毒,其全基因组序列分析研究甚少,国内尚无报道。本研究旨在探明MuVA在我国新疆蟠桃中的感染情况,分析MuVA pp分离物的基因组、系统进化及致病性,为MuVA的防治提供科学依据。【方法】使用RT-PCR方法对田间蟠桃样品进行MuVA检测,采用5′/3′cDNA末端快速扩增(RACE)技术确定MuVA pp分离物的全基因组序列,并运用生物信息学软件分析MuVA pp分离物的基因组序列特征和系统进化关系。利用Gibson组装策略构建该分离物的基因组全长cDNA克隆,并通过农杆菌介导的方法对其侵染性进行接种测试。【结果】RT-PCR检测结果表明,30份疑似病毒病样本中有10份感染了MuVA,不同蟠桃品种感染率由高到低分别为‘七月蟠’(4/9)、‘八一蟠桃’(5/13)、‘中熟八一’(1/8);MuVA pp分离物基因组全长为7 647 nt,基因组由5′非翻译区(5′UTR)、3′UTR和两个重叠的开放阅读框(ORF)组成,编码甲基转移酶(Met)、RNA解旋酶(Hel)、RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)、外壳蛋白(CP)和运动蛋白(MP);序列分析结果显示,MuVA pp分离物与已报道的MuVA pm14分离物基因组的核苷酸和多聚蛋白氨基酸序列一致性分别为80.8%和82.7%,两者的多聚蛋白存在406个氨基酸残基的差异,分布在Met(21个)、Hel(29个)、RdRp(19个)、CP(18个)和其他(319个)。与MuVA pm14分离物显著不同的是5′UTR,核苷酸序列一致性仅为74.6%,编码的蛋白质中,MP变异最大,氨基酸一致性为80.9%,RdRp最保守,氨基酸一致性最高,为94.0%;系统发育分析结果显示,MuVA pp分离物与MuVA pm14分离物的亲缘关系最近,且MuVA有宿主和地理特异性的趋势,李子分离物与梅分离物聚集成簇,而桃分离物单独成支;构建的pCB301-MuVA侵染性克隆可以系统侵染苋色藜,并未引起症状,导致三生烟接种叶产生过敏性坏死,但不能引起系统侵染,也不能侵染昆诺藜、心叶烟、西方烟、本氏烟、番茄、黄瓜和南瓜。【结论】成功获得了蟠桃MuVA pp分离物的全基因组序列,其基因组为单链正义RNA,大小为7 647 nt,不含3′端poly(A)尾,编码两个ORF;通过摩擦接种证实MuVA不能侵染草本植物;构建了具有侵染活性的MuVA pp分离物的全长c DNA侵染性克隆载体pCB301-MuVA,可系统侵染苋色藜,且无明显症状,导致三生烟接种叶产生过敏性坏死,未引起系统侵染,这为进一步研究MuVA的致病分子机理提供了参考依据。

解淀粉欧文氏菌噬菌体Kuerle的分离、基因组测定及其裂解功能分析

【背景】解淀粉欧文氏菌(Erwiniaamylovora)是仁果类果树火疫病的病原体,对全球苹果和梨的生产构成严重威胁。随着抗生素耐药菌株的出现,火疫病的防治面临巨大的挑战。【目的】分离一种新的裂解解淀粉欧文氏菌的噬菌体,并分析该噬菌体裂解相关基因的功能,为火疫病的防治提供新的选择。【方法】以解淀粉欧文氏菌Ea102为宿主菌,采用双层平板法从流行火疫病的果园土壤中分离噬菌体。通过噬菌斑和透射电镜观察其形态。用PacBio测序技术测定噬菌体基因组,SPAdes组装序列,RAST注释基因组。通过大肠杆菌原核表达系统分析噬菌体Kuerle的裂解机制。【结果】分离纯化出一株裂解解淀粉欧文氏菌的噬菌体,命名为Kuerle。Kuerle由二十面体衣壳的头部和短尾组成,潜伏期约为50 min,裂解量约为240 pfu/cell。噬菌体基因组全长75599 bp,GC含量48.0%,末端有393 bp的重复序列,未发现与溶原调控相关的基因。共预测到85个开放阅读框(open reading frame,ORF),其中33个已知功能蛋白中包含一个由3550 aa组成的巨大病毒颗粒相关的RNA聚合酶(virion-associated RNA polymerase,vRNAP),该vRNAP是Schitoviridae科噬菌体的主要特征之一。病毒粒子和基因结构表明噬菌体Kuerle属于有尾噬菌体类的Schitoviridae科病毒。聚集在DNA晚期表达区的3个裂解相关基因holin、endolysin和spanin组成了“裂解盒”。在大肠杆菌中Kuerle-holin的表达会抑制细胞的生长,而Kuerle-endolysin的表达可裂解细胞。二者共表达时Kuerle-holin会加速Kuerle-endolysin引起的细胞裂解。用叠氮化钠抑制细菌的一般分泌系统(Sec)或Kuerle-endolysin N端信号序列的缺失均会导致endolysin裂解功能丧失。上述结果表明噬菌体Kuerle具有pinholin-SAR endolysin裂解系统。Kuerle-holin(pinholin)使细胞质膜去极化以激活分泌的Kuerle-endolysin(SAR endolysin)降解肽聚糖层。【结论】Kuerle是一株烈性噬菌体并且Kuerle-endolysin抑菌效果显著,为后续火疫病生防试剂的制备提供了理论依据和研究材料。

小拟南芥COR15a基因的克隆及序列分析

拟南芥的COR15a基因受低温处理、ABA及干旱诱导表达,与植物的低温驯化有关。根据拟南芥序列,利用PCR技术从小拟南芥基因组中克隆了AtCOR15a的同源基因ApCOR15a。2个基因具有相同的结构,ApCOR15a编码139个氨基酸,其序列有84%与AtCOR15a蛋白相同。

水杨酸诱导表达AtCBF1的转基因烟草研究

CBF是植物低温驯化过程中的关键性调控因子,过量表达CBF可显著提高转基因植物的非生物胁迫抗性。但是,组成型高表达CBF基因常导致转基因植株生长受阻。通过使用人工合成的水杨酸诱导型启动子,结果发现拟南芥CBF1基因在转基因烟草中受低浓度水杨酸诱导表达,且不影响烟草的生长发育。本研究结果说明,组合化学诱导型启动子和CBF基因,可以用于提高作物的抗环境胁迫的遗传改良中。

转β-1,3-葡聚糖酶基因和几丁质酶基因棉花

为了提高棉花的抗枯、黄萎病的能力 ,用花粉管通道法 ,将烟草 β - 1 ,3-葡聚糖酶基因和菜豆几丁质酶基因导入棉花 ,获得了抗卡那霉素的转化植株。经PCR、PCR -SouthernBlot检测 。

转基因棉PCR与卡那霉素检测的比较

对尚未提纯的转基因棉 1 79自交后代进行卡那霉素检测和PCR检测 ,结果表明卡那霉素检测与PCR检测结果一致 :抗卡那霉素植株PCR检测均呈阳性 。

拟南芥CBF基因的克隆

CBFs是拟南芥中能与低温响应元件CCGAC结合的转录因子,通过诱导冷调节基因(COR)的表达从而增强植物的耐冻性。CBFs由一个小的基因家族编码,包括3个成员:CBF1、CBF2和CBF3,在序列上高度相似。我们根据其编码基因的启动子和终止子中的一致序列,设计了一对PCR引物,用一次反应即同时获得了这3个基因的克隆。

水分胁迫下葡萄叶片脯氨酸和可溶性总糖积累与叶龄的关系

测定1年生葡萄的不同叶龄叶片中脯氨酸和可溶性总糖的含量,结果表明:水分胁迫使幼龄叶片的脯氨酸和可溶性总糖含量增加,而减少了在成熟叶片中的含量。说明水分胁迫导致渗透调节物质由老组织向幼嫩组织运输并积累,从而提高了幼嫩组织的干旱适应能力。

利用目的基因转化技术培育棉花抗病新品种

用花粉管通道法将菜豆几丁质酶基因与烟草 β 1、3葡聚糖酶基因双价植物表达载体pBLGC导入新疆棉花主栽品种 (系 )系 5 5 0、82 2、130 4、石远 32 1。通过卡那霉素检测、PCR Southern验证、抗黄萎病、枯萎病性筛选 ,得到抗病性良好且遗传性稳定的转基因棉花。经过 6年 10个世代的选育 ,育成抗枯萎病、抗 (耐 )

油菜素内酯提高香蕉幼苗抗冷性的效应

冷胁迫条件下的香蕉幼苗分别经不同浓度的BR处理后,相对于对照来说,在一定的处理浓度范围内,可以明显的降低电解质外渗率,提高低温胁迫下香蕉幼苗叶片中SOD的活性,一定程度上提高了低温胁迫下香蕉幼苗叶片中可溶性蛋白的含量,减缓叶片中MDA的含量变化,可溶性糖含量明显的提高,减少叶片萎蔫面积和死亡率,同时,明显的减缓了叶片中叶绿素降解的速度。这些代谢产物的变化,对提高香蕉幼苗冷胁迫期间的抵抗能力起着非常关键和重要的作用。保护效果最好的浓度是:0.9mg·L^(-1)。

转拟南芥ICE1基因增强烟草抗寒性的研究

ICE1是CBF冷响应通道的上游转录调控因子,通过与CBF启动子中MYC顺式作用元件的结合激活CBF3基因表达。采用RT-PCR方法,从拟南芥获得AtICE1基因,将AtICE1导入pCAMBIA1301构建35S∷AtICE1植物表达载体。通过根癌农杆菌GV3101,将AtICE1基因导入烟草,T1代植株经潮霉素抗性筛选,PCR、RT-PCR检测,结果表明AtICE1基因已经整合到烟草基因组中,并在转录水平表达;在正常生长条件下,转基因烟草与对照烟草的生长未见明显区别,而在瞬时低温冻害下,转基因烟草存活率明显高于对照烟草植株,说明AtI-CE1基因可以提高低温敏感作物的耐寒性。

棉花GhFTL1基因的克隆及初步功能分析

通过RT-PCR结合RACE技术,从新疆陆地棉品种新陆早33中克隆到一个FT类似基因,命名为GhFTL1基因(登录号:HM631972)。该基因ORF(Open Reading Frame)全长为525 bp,可编码174个氨基酸,与其它植物中克隆的FT同源蛋白高度相似,含有FT蛋白亚家族两个关键的氨基酸残基及保守氨基酸基序。该基因在根、茎、花、叶片、纤维和胚珠中均有表达,且在叶片和胚珠中的表达要稍高于其它组织。系统进化分析表明GhFTL1属于FT亚家族成员。在18个已经证明可以促进植物开花的FT同源基因中,GhFTL1同苹果的MdFT1的遗传距离最接近。在拟南芥中过量表达GhFTL1,T1转基因植株要比野生型明显提早开花。表明GhFTL1可能属于开花途径中的重要作用因子之一。

脱落酸对香蕉幼苗抗寒性的影响

分别用不同浓度的脱落酸(ABA)溶液喷洒香蕉幼苗后,模拟自然降温过程进行冷胁迫处理,发现不同浓度的ABA均不同程度地提高香蕉幼苗冷胁迫期间叶片SOD活性及MDA、可溶性糖和可溶性蛋白含量,降低细胞质泄漏,减缓叶绿素降解,减少叶片萎蔫面积和死亡率,从而缓解了低温对香蕉幼苗的冷伤害程度,其中以浓度为20mg/L的ABA保护效应最明显。

GFP基因在新疆小拟南芥和拟南芥中的表达分析

以质粒pMCB30为模板,扩增GFP基因,连接到载体pCMBIA2300-35S-OCS上,构建过量表达载体p35S:GFP,将其转入农杆菌GV3101.通过农杆菌介导法将p35S:GFP载体分别转入新疆特色植物小拟南芥和拟南芥中.T0代经含有卡那霉素的1/2MS培养基筛选,获得了T1代转基因小拟南芥2株,T1代转基因拟南芥9株.通过激光共聚焦显微镜观察,在转基因小拟南芥和拟南芥的根尖细胞中均可检测到GFP绿色荧光蛋白;对转基因植株进行PCR扩增,均可检测到GFP基因,表明GFP基因已成功转入小拟南芥和拟南芥中.该研究建立了小拟南芥的遗传转化体系,为进一步利用GFP基因和进一步研究小拟南芥的功能基因奠定基础.

PEG处理下葡萄试管苗脯氨酸及内源ABA含量变化的研究

用不同浓度的PEG处理全球红葡萄生根试管苗,造成一定程度的水分亏缺,观察葡萄试管苗在水分胁迫下的生理反应。结果表明:PEG处理导致葡萄试管苗脯氨酸的积累和内源ABA的迅速增加。6%PEG胁迫处理66h时脯氨酸含量达到高峰,72h又有所下降;而3%PEG胁迫处理脯氨酸含量仍保持持续上升趋势。内源ABA在12h内达到第一个峰值,含量为对照的两倍多,并维持比对照略高的水平;而6%PEG胁迫处理植株在48h时ABA再次积累,含量比对照高100多倍。

海岛棉GbMFT1基因的克隆及表达分析

通过RT-PCR和RACE技术,从新疆海岛棉品种新海14中克隆得到了一个MFT(MOTHER OF FT AND TFL1)类似基因,命名为GbMFT1基因(GenBank登录号为KC513744)。GbMFT1基因的开放阅读框(ORF)为528 bp,编码175个氨基酸的蛋白,含一个磷脂酰乙醇胺结合蛋白(PEBP)结构域。GbMFT1蛋白的羧基端含有MFT蛋白都含有的脯氨酸。系统进化树分析表明GbMFT1编码产物与葡萄、番茄亲缘关系较近,属于同一进化分支。实时荧光定量PCR分析表明,GbMFT1基因在棉花的不同组织中均有表达,在花瓣中的表达量较高;在纤维发育的不同时期中均有表达,在开花后2 d的胚珠、9 d的纤维中表达量最高。半定量RT-PCR结果表明,GbMFT1基因在刚萌发的种子中表达量高,用不同浓度的ABA处理种子后其表达变化不明显,表明GbMFT1基因的表达不受ABA的调节。

基因枪转化法在棉纤维细胞中瞬时表达外源基因的研究

试验运用了0 d,1 d的棉胚珠为受体,GUS基因为报告基因,用基因枪直接对胚珠表皮细胞进行轰击。整个表达载体包括两个部分,第一部分是由CaMV35S调控的GUS基因,第二部分是由棉纤维特异表达启动子(RDL1)调控的目标基因,因此目标基因与GUS报告基因能在同一个单纤维细胞中同时表达,从而提供了一个直观的在单纤维细胞中验证目标基因的表达与纤维发育关系的方法。研究中对受体棉花胚珠的发育时间、基因枪的轰击压力、轰击距离及轰击次数等影响转化效率的因素进行了分析优化。结果表明,最佳的转化组合条件是:以开花一天的棉花胚珠为受体,当轰击压力为1100 psi,轰击距离为9cm,轰击次数为2次时可达到最高的转化率,并能观察到稳定的GUS表达。

小拟南芥Na^+/H^+逆向转运蛋白基因的克隆及生物信息学分析

为了克隆新疆特色植物小拟南芥(Arabidopsis pumila)的Na+/H+逆向转运蛋白基因,本研究以经200mmol/L NaCl胁迫诱导12h的叶片总cDNA为模板,采用RT-PCR技术克隆到Na+/H+逆向转运蛋白基因,命名为ApNHX1(GenBank登录号:JF357965)。结果表明:ApNHX1全长开放阅读框1617bp,编码538个氨基酸残基。利用相关的生物信息学软件对ApNHX1蛋白氨基酸的等电点、结构域、二级结构组成、跨膜结构、亲水性等进行研究,并且构建植物NHX1基因家族系统进化树,结构表明ApNHX1和拟南芥、鼠尔芥、盐芥和油菜等的NHX1同源基因遗传距离最为接近,属于Ⅰ型液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白。因此,构建植物过量表达载体p35S::ApNHX1,转化到农杆菌GV3101中,这为进一步研究基因功能奠定基础。

啤酒花茎段培养及快速繁殖技术研究

以啤酒花的幼嫩茎段作为外植体 ,研究出理想的一次性成苗培养基 :MS+ 6- BA 0 .0 1mg/ L+ IAA0 .1 mg/ L+琼脂 6.5g/ L+葡萄糖 2 %。试管苗月增殖率 4.2 ,生根率 1 0 0 % ,成苗率 90 %。采用试管苗微扦插的方式进行快速繁殖 ,经锻炼后直接移入经改造后的土壤中 ,移栽成活率达 93.8%。

棉花DELLA蛋白基因GhGAI3和GhGAI4启动子的克隆及序列分析

棉纤维是纺织行业的重要原材料。赤霉素能够促进棉纤维的生长发育,而DELLA蛋白又是赤霉素信号转导通路中的关键调控因子,因此研究棉花DELLA蛋白基因表达的调控模式,对阐明棉纤维生长发育的分子生物学机理具有重要意义。本研究根据两个棉花DELLA蛋白基因GhGAI3和GhGAI4序列设计特异引物,以陆地棉新陆早13号的基因组DNA为模板,用基因组步移法克隆了棉花DELLA蛋白基因GhGAI3和GhGAI4的启动子。对两个启动子进行序列分析表明,这两个启动子均具有真核生物典型的核心启动子区,同时也都具有一个或多个光响应元件和赤霉素响应元件,说明这两个基因可能受到光信号和赤霉素信号的调控,这与其它植物中DELLA蛋白的表达模式是一致的。此外,这两个启动子还具有各种转录调控相关的顺式作用元件,比如其它激素类的响应元件和逆境胁迫响应元件,说明棉花中DELLA蛋白基因可能在响应其它激素信号以及逆境胁迫中也起到一定的作用。