奶牛围产期外周血T淋巴细胞亚群动态及细胞因子IL-2、IL-4基因转录水平分析

通过检测奶牛CD3+、CD4+和CD8+淋巴细胞亚群的动态及细胞因子IL-2、IL-4在分娩前后21d内的基因转录水平的变化,以探讨此阶段奶牛免疫机能受损的机理。应用流式细胞术检测CD3+、CD4+、CD8+淋巴细胞亚群的动态变化及实时荧光定量检测细胞因子IL-2、IL-4mRNA的表达量。结果表明:血液中CD3+淋巴细胞的比例在产前21d内占(50.8±4.61)%,产后14d内降低到(39.21±4.98)%,两者差异极显著(P<0.01);CD4+淋巴细胞在产前21d内保持较高水平,达(21.38±0.65)%,产后21d内维持在(6.89±0.32)%的较低水平,且与产前差异显著(P<0.05);CD8+淋巴细胞的比例在产犊前逐渐升高,到产犊时达到最高水平(16.90±2.02)%,差异显著(P<0.05);CD4+/CD8+淋巴细胞的比率在产前>1,产后<1。IL-2mRNA的表达量在产后0～14d内下调,之后上升。IL-4mRNA的表达量分娩时期达到最高,随后下降,至第7天降到最低。奶牛在围产期阶段尤其是分娩前后14d内机体处于免疫抑制状态,可能是由于自身的CD3+、CD4+和CD8+T淋巴细胞的亚群的数量和比例发生改变及细胞因子IL-2、IL-4mRNA表达量下调引起的。

茶多酚对氧化应激所致奶牛乳腺上皮细胞损伤的保护作用

用过氧化氢(H2O2)建立体外奶牛乳腺上皮细胞的氧化应激损伤模型,研究不同质量浓度茶多酚对氧化应激所致奶牛乳腺上皮细胞损伤的影响。MTT法检测细胞存活率,比色法检测细胞培养液中丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)和乳酸脱氢酶(LDH)活性,流式细胞术检测细胞凋亡情况,分光光度法检测天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)的活性。结果显示:与H2O2损伤模型组相比,20～100μg.mL-1茶多酚处理组的奶牛乳腺上皮细胞存活率、SOD活性显著升高,而MDA含量、LDH与Caspase-3相对活性与细胞凋亡率均下降,其中以100μg.mL-1茶多酚处理组效果最显著,说明一定质量浓度的茶多酚可以缓解氧化应激所致的奶牛乳腺上皮细胞的损伤,提高细胞存活率,抑制乳腺细胞凋亡。结论:茶多酚对乳腺上皮细胞氧化应激损伤具有保护作用,其保护作用可能与降低MDA含量,增强SOD活性及抑制Caspase-3活性有关。

奶牛HSP70 基因表达及其连锁微卫星标记与耐热性状的相关性

为了研究奶牛HSP70基因的mRNA表达规律和其紧密连锁的3个微卫星标记与耐热性状的相关性,文中在日平均温湿度指数(THI)为86.2(高温期)、70.9(临界高温期)和56.8(适温期)时分别采集10头处于同一泌乳阶段的同龄健康奶牛的尾静脉血,采用实时荧光定量RT-PCR技术分析不同条件下奶牛HSP70基因在外周血淋巴细胞的mRNA表达水平。结果表明:随THI升高,HSP70mRNA表达量呈上升趋势,高温期奶牛的外周血淋巴细胞HSP70mRNA表达丰度极显著高于临界高温期和适温期(P<0.01),且与奶牛的耐热指标具有一定的遗传相关,表明HSP70基因可以作为奶牛热应激反应的候选基因。选取23号染色体上与HSP70紧密连锁的3个微卫星标记BMS468、BM1258和BM1815,用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析其在160头荷斯坦奶牛的遗传变异情况,利用最小二乘法拟合线性模型初步探索了这3个微卫星座位与奶牛耐热指标的关系。相关分析表明:耐热系数、红细胞钾含量及高温期日产奶量下降率的最有利基因型在BMS468基因座和BM1815基因座上,分别为134bp/128bp(P<0.05)和186bp/148bp(P<0.05);BM1258基因座上,最有利基因型101bp/99bp的高温期日产奶量下降率最低(P<0.05)。

转化生长因子β1对奶牛乳腺组织细胞凋亡及HSP70蛋白表达的影响

应用乳酸脱氢酶（LDH）活力测定、透射电镜、免疫组化和Caspase-3活性分析等技术，检测转化生长因子β1（TGF—β1）对奶牛乳腺组织细胞活性、凋亡和HSP70蛋白表达的影响。用10ng·mL^-1TGF—β1处理乳腺组织48h，分别在不同时间点收集组织和培养液检测各指标，以0h不加TGF—β1作为对照组。结果显示，随TGF—β1作用时间的延长组织细胞活率逐渐降低，24h和48h组显著低于对照组（P〈0．05），LDH活性逐渐升高，6、12、24和48h组极显著高于对照组（P〈0．01）。处理12、24和48h组织DNA发生断裂；Caspase-3活性在24h达到高峰，并极显著高于对照组（P〈0．01）；上皮细胞逐渐由腺泡脱落，腺泡塌陷，但间质结构基本完整；超微结构观察显示，48h时上皮细胞呈现染色质凝集、线粒体肿胀等明显凋亡特征，而成纤维细胞胞浆致密、线粒体丰富，结构较完整、处理3～12h后组织过表达HSP70，且均显著高于对照组（P〈0．05）。结果提示：TGF—β1以促进上皮细胞凋亡的方式促进奶牛乳腺发生退化。

TGF-β_1对奶牛乳腺上皮细胞增殖、凋亡及HSP70蛋白表达的影响

【目的】探讨TGF-β1对奶牛乳腺上皮细胞增殖、凋亡和HSP70蛋白表达的影响。【方法】TGF-β1作用乳腺上皮细胞不同时间,收集细胞及培养液,应用MTT检测细胞增殖、流式细胞术检测细胞凋亡率、比色法检测LDH活性、琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性、Western bolt技术分析HSP70蛋白的表达量。【结果】1、5、10ng·ml-1的TGF-β1均能抑制乳腺上皮细胞的增殖,且随浓度增加抑制作用加大,呈现剂量依赖性,其中10ng·ml-1TGF-β1组与对照组差异显著(P<0.05);10ng·ml-1TGF-β1作用于乳腺上皮细胞,随着作用时间的延长,细胞凋亡率逐渐升高,其中6、12和24h与对照组相比差异极显著(P<0.01);LDH活力随作用时间延长而升高,12、24h与对照组差异极显著(P<0.01);DNA完整性随TGF-β1作用时间的延长发生不同程度降解;TGF-β1作用2～6h细胞大量表达HSP70,6h达到高峰,而后下降,2～12h的表达量均极显著高于对照组(P<0.01)。【结论】TGF-β1可以抑制奶牛乳腺上皮细胞的增殖,具有浓度依赖性。10ng·ml-1TGF-β1可以显著增加细胞凋亡率,提高细胞培养液中LDH活力,使细胞DNA发生不同程度的降解,同时HSP70蛋白随TGF-β1作用时间发生显著的表达变化。本试验结果表明,TGF-β1可以以促进上皮细胞凋亡的方式,促进奶牛乳腺发生退化。

奶牛HSP70基因3'-侧翼区多态性分析及其与生产性能的关系

以160头荷斯坦和娟姗奶牛作为研究对象,分别测定了其在不同温度条件下,直肠温度、呼吸频率、产奶量及乳成分,并进行了统计分析。同时设计引物扩增HSP70基因3'-侧翼区,通过PCR-SSCP技术分析HSP70基因3'-侧翼区的多态性,并发现一个多态位点。结果表明:扩增片段为292bp,扩增产物有基因多态性,共发现4种基因型,分别为荷斯坦牛的AA(H)型、AB(H)型和娟姗牛的AA(J)型、AB(J)型。其中B基因可能为抗热应激基因,这4种基因型奶牛个体的生产性能差异不显著(P>0.05)。

公牛HSP基因多态性与其精液品质及后裔性能的相关分析

以142头公牛为研究对象,以HSP为耐热性状的候选基因,分别扩增125和233 bp 2个片段,采用PCR-SSCP方法检测HSP基因多态性,并对PCR产物测序和序列分析。结果表明:HSPA8存在T3358C转换突变,该突变使缬氨酸(Val)变为异亮氨酸(Ile),产生2种基因型AA和AB,频率分别为0.577 5和0.422 5;HSPA1A发现A6201C和T6202A颠换突变,其中T6202A突变使苯丙氨酸(Phe)变为异亮氨酸(Ile),产生了5种基因型AA、AB、BB、AC和BC,频率分别为0.345 1、0.493 0、0.084 5、0.035 2和0.042 2。应用SPSS17.0软件采用最小二乘拟合线性模型,分析基因座位不同标记基因型与后裔测定性能和精液品质的相关性,结果表明:1)在HSPA8,AA基因型个体产量育种值显著高于AB型(P<0.05);在HSPA1A,BB基因型个体产量育种值显著高于AC型(P<0.05),AB基因型个体蛋白育种值显著高于AC型(P<0.05)。2)在HSPA8,精子密度、精子活力和顶体完整率AA均显著高于AB(P<0.05),而精子畸形率AA显著低于AB(P<0.05);在HSPA1A,精子密度BC极显著低于AA(P<0.01),精子活力AC极显著低于AB(P<0.01),而精子畸形率AB极显著高于AC(P<0.01)。

牛血液组胺浓度、TLR4基因多态性与抗蜱能力的关联分析

为研究牛TLR4基因多态性与抗蜱能力的关系,以正在杂交育种的BMY牛和其亲本婆罗门牛、红安格斯牛共103头牛为研究对象,在人工草场全放牧条件下测定微小牛蜱的感染量和静脉血组胺浓度,并以64头中国荷斯坦牛和加系西门塔尔牛(Simmental)为对比,利用PCR-SSCP扩增228bp的目的片段,检测TLR4的多态性,结果发现了535(A/C)、546(T/C)、605(T/A)、618(G/C)4个SNPS;中国荷斯坦牛和加系西门塔尔牛有A等位基因,红安格斯牛有A、B两个等位基因和AA、AB两种基因型,BMY牛和婆罗门牛有A、B、C三个等位基因和AA、AB、BB、BC四种基因型。牛血液组胺浓度与微小牛蜱的感染量呈负相关,其中BMY牛的相关性极显著(P<0.01);BB基因型的牛感染蜱的量显著低于AA基因型,静脉血组胺浓度显著高于BB型(P<0.05);TLR4基因突变可影响牛血液组胺浓度和微小牛蜱感染而引起的全身免疫反应水平,B等位基因可作为婆罗门杂交牛抗蜱选育的分子标记。BMY牛的抗蜱选育已经获得进展。

妊娠奶牛PAPPA和PAG mRNA表达规律的研究

[目的]分析PAPPA(妊娠相关血浆蛋白A)和PAG(妊娠相关糖蛋白)mRNA在不同妊娠时期奶牛外周血的表达规律。[方法]提取奶牛空怀期和妊娠30 d、60 d、90 d、150 d和240 d血浆中游离RNA,RT-PCR扩增PAPPA和PAG的基因,分析其在妊娠期的相对表达水平,并研究其表达规律。[结果]PAG基因在空怀组和妊娠牛均有表达,在牛妊娠240 d时相对表达水平达到高峰;PAPPA从妊娠30 d时表达水平开始升高,并在妊娠150 d时达到最高水平。[结论]本研究为深入探讨奶牛PAPPA和PAG基因调控规律和早期妊娠诊断提供了参考。

不同获能时间豚鼠精子运动参数分析

目的:评价精子运动参数在研究豚鼠精子超激活运动中的作用,进一步确定豚鼠精子超激活运动的指标。方法:采用计算机辅助精液分析(CASA)系统检测豚鼠精子不同孵育时间(0、1、3、5、7h)的运动参数。结果:豚鼠精子孵育过程中精子曲线运动速度(VCL)、平均路线速度(VAP)、头部侧摆幅度(ALH)随孵育时间的增加而提高,并在5h达到最大值,而直线运动速度(VSL)、直线性(LIN)、向前性(STR)、鞭打频率(BCF)随孵育时间的增加而降低,并在5h达到最低值。结论:豚鼠精子获能培养过程中在发生超激活运动前精子的运动方式可发生很大的变化。

牛Pbx-1基因的电子克隆及生物信息学分析

新基因全长cDNA序列很难获得,但电子克隆却提供了基因克隆的一种策略。利用小鼠Pbx-1基因编码序列(NM_183355)为种子序列进行电子克隆获得牛Pbx-1基因完整编码序列。然后,用生物信息学方法分析了牛的Pbx-1基因的结构,密码子偏性和氨基酸的同源性等。结果表明:该基因cDNA全长1 754 bp,无内含子,最大开放阅读框1 305 bp,编码434个氨基酸,预测其编码的蛋白分子量为47 189.5 D a,与小鼠的同源性为81%。