大鼠过敏毒素C5a的纯化与鉴定

过敏毒素C5a是补体活化过程中由补体成份5(C5)产生的一种生物活性肽;在体内外具有多种生物学功能。作为致痉挛原(spasmogen),大鼠C5a是迄今已知的活性最强的生物因子,本文报道从酵母多糖活化的大鼠血清中纯化C5a及C5a des Arg的三步层析法及对所获C5a生物化学性质初步鉴定的结果。

用硝酸纤维素膜固定的蛋白质制备单特异性抗体

抗体在医学和分子生物学领域有着非常广泛的用途,当应用抗体对某个蛋白质进行鉴定、定位及纯化时,抗体的特异性常是影响实验结果的关键因素之一。单克隆抗体是目前已知特异性最高的抗体,但制备单克隆抗体常遇到一些问题。如:有的抗体难以诱导出来,有的抗体产量非常低。

体外扩增γδT细胞的肿瘤组织趋向性

目的探查体外扩增的γδT细胞向结直肠癌细胞迁移的能力。方法采用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMCs),并利用固相化抗T细胞受体(TCR)γδ抗体进行2周的体外扩增。对扩增的γδT细胞进行免疫荧光染色和流式细胞仪分析或流式细胞仪分选。采用Bioplex 200流体芯片系统分析细胞因子和趋化因子的表达。采用transwell小室进行趋化实验。结果体外扩增的γδT细胞主要表达CCR5和CXCR3 2种趋化因子受体。4种结直肠癌细胞系和10种结直肠癌肿瘤组织中存在CCR5和CXCR3配体的表达。体外扩增的γδT细胞在TCR激活的情况下可以大量产生Th1和Th2型细胞因子,进一步募集γδT细胞。特别是其产生的干扰素γ(IFN-γ)能够提高结直肠癌细胞CXCR3配体的表达量,从而进一步促进γδT细胞的趋近。结论本研究结果为γδT细胞过继免疫治疗结直肠癌提供了重要指征。

抗人SARS病毒单链抗体库的构建

目的:利用细胞内重组的方法,构建大库容量的人源性抗SARS病毒单链抗体(scFv)库,为筛选SARS病毒抗原的人源性抗体奠定基础。方法:取6例SARS康复患者的80mL外周血,分离淋巴细胞后提取总RNA。分离纯化mRNA并反转录成cDNA后,扩增抗体重链、轻链可变区基因片段。然后经重叠延伸PCR装配成scFv基因并克隆入噬粒载体pDAN5中,电转化大肠杆菌TG1构建初级抗体库。制备初级库噬菌体后,感染大肠杆菌BS1365进行细胞内重组制备次级抗体库。结果:初级库库容量为3×109,在大肠杆菌BS1365中重组后得到3×1011的次级抗体库。结论:细胞内重组方法的应用可使大库容量抗体库的构建变得简单易行。构建的抗SARS病毒单链抗体次库不仅接近人类天然抗体库的水平,而且多样性好,为筛选抗SARS病毒抗原的抗体提供了保证。

AIDS患者γδ T细胞能够杀伤自体HIV感染的CD4^+ T细胞

目的建立自体人类免疫缺陷病毒(HIV)感染的CD4+T细胞模型,检测获得性免疫缺陷综合征(AIDS)患者γδT细胞对自体HIV感染的CD4+T细胞的杀伤作用。方法分离健康志愿者和未治疗的AIDS患者外周血单个核细胞(PBMCs),磁珠分选获得高纯度的CD4+T细胞,加入植物血凝素(PHA)和白细胞介素-2(IL-2)共同培养,建立自体HIV感染的CD4+T细胞模型。流式细胞术检测HIV-P24+CD4+T细胞的比例。乳酸脱氢酶(LDH)法测定γδT细胞的细胞毒作用。结果培养到第10天时,HIV-P24+CD4+T细胞的比例达到最高值。AIDS患者的γδT细胞不仅能够杀伤自体HIV感染的CD4+T细胞(细胞溶解率为71.1±97),而且对HIV也有一定的杀伤作用(细胞溶解率为24.2±18.2)。而健康志愿者γδT细胞对自体CD4+T细胞没有杀伤作用(细胞溶解率为4.3±10.1)。结论 AIDS患者γδT细胞能够杀伤自体HIV感染的CD4+T细胞,为采用γδT细胞过继免疫治疗AIDS提供了依据。

人外周血γδ T细胞的可溶性anti-TCR γδ抗体扩增及其培养和保存的条件

目的:比较人外周血γδT细胞不同的制备方法,摸索适于临床应用的培养和保存条件。方法:分离人外周血单个核细胞,分别以固相化和可溶性anti-TCRγδ抗体进行刺激,以添加小牛血清或人AB血浆的RPMI1640培养液或AIM V无血清培养液进行培养,采用锥虫蓝染色法检测γδT细胞存活率,采用免疫荧光染色法考察γδT细胞的纯度和亚型,采用乳酸脱氢酶(lacate dehydrogenase,LDH)法检测γδT细胞对不同肿瘤细胞系的杀伤作用。结果:添加15%小牛血清和添加5%人AB血浆的RPMI1640培养液对γδT细胞的培养效果接近,均优于AIM V无血清培养液。可溶性抗体与固相化抗体扩增外周血γδT细胞的效果相似;可溶性抗体扩增的γδT细胞受体(Tcell receptor,TCR)库容完整,同时具有TCR Vδ1和Vδ2两种亚型;对肺癌、肝癌和卵巢癌细胞系均有体外杀伤活性。这些γδT细胞在含1%人AB血浆或0.25%人血白蛋白的生理盐水中、4℃条件下保存12h,细胞存活率仍达95%以上。结论:可溶性anti-TCRγδ抗体和含有人AB血浆的RPMI1640培养液可以用于人外周血γδT细胞的体外扩增,扩增得到的γδT细胞在含有血浆或白蛋白的生理盐水中稳定性较好。

蛋白质组学技术在人体简单系统蛋白质全谱检测的应用

蛋白质作为生物体最基本的功能单位 ,一直被看作是开启生命奥秘的金钥匙。但由于其数量巨大、种类繁多、结构复杂、功能变化莫测 ,使人们对它的研究始终难以有突破性的进展。能够像研究基因组那样大批量研究蛋白质即绘制人体蛋白质图谱一直是科学家努力的目标。但由于方法的局限 ,过去的蛋白组学研究通常集中在用比较蛋白组学的分析方法去研究人体蛋白。随着蛋白组学分离技术 (二维电泳、质谱等 )的不断改进与提高 ,人体简单系统蛋白质全谱的检测已成为可能。通过对目前蛋白质全谱研究最为全面的脑脊液、尿液及唾液检测技术的分析介绍 。

特异性CDR3区取代型γδTCR转染细胞的构建及生物学功能鉴定

目的:建立特异性CDR3区取代型γδTCR转染细胞平台。方法:利用搭桥PCR的方法将已知的γδT细胞克隆DBS4.3特异性CDR3编码序列嵌入到γ9和δ2cDNA序列中,取代原有的CDR3区序列,获得的全长γ9和δ2链分别插入真核表达载体pREP7和pREP9中,共转染J.RT3-T3.5细胞,双压力抗生素筛选获得表达特异性γδTCR的转染细胞,通过ELISA和Re-altime PCR检测该转染细胞在接受抗原刺激后IL-2的分泌情况。结果:ELISA和Realtime PCR结果显示表达DBS4.3特异性γδTCR的转染细胞在DBS4.3特异性抗原仲丁胺和抗γδTCR抗体刺激作用下,活化分泌IL-2。结论:构建了特异性CDR3区取代型γδTCR转染细胞平台,为研究γδTCR识别抗原的机制奠定了基础。

具有生物学活性的hMSH2蛋白在昆虫sf9细胞中的表达

目的表达具有生物活性的hMSH2蛋白。方法用搭桥PCR获得hMSH2全长基因,构建pAcGP67B-hMSH2重组质粒,与AcNPV昆虫病毒DNA共转染昆虫细胞sf9,表达hMSH2蛋白(同时构建pET30a-hMSH2重组质粒,用大肠杆菌表达hMSH2蛋白);Western blot鉴定hMSH2蛋白;ELISA,流式细胞仪检测蛋白与OT3肽及TCRγδ的结合特异性;检测细胞增殖(MTT法)和细胞因子分泌,观察重组蛋白体外活化γδT细胞的生物学功能。结果克隆到正确的hMSH2基因,并将其插入到表达载体pAcGP67B和pET30a中的正确位置。经Western blot鉴定获得了hMSH2蛋白。用昆虫病毒表达载体系统表达的hMSH2蛋白能与其探针肽OT3及TCRγδ特异性结合,并能在体外刺激γδ细胞增殖及分泌IFN-γ,其活性更优于原核表达的蛋白。结论成功利用昆虫病毒载体表达系统得到了比原核大肠杆菌表达系统更具生物活性的hMSH2蛋白。

抗RAET1G2单克隆抗体的研制和初步鉴定

目的:制备鼠源抗RAET1G2单克隆抗体,并对其特异性进行鉴定。方法:以原核表达的RAET1G2蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,运用B淋巴细胞杂交瘤技术制备抗RAET1G2单克隆抗体;用免疫双扩散方法鉴定Ig亚类;Western blot鉴定单克隆抗体的特异性。结果:获得了4株可分泌特异性抗RAET1G2抗体的杂交瘤细胞株7A11、9C6、10F9和12F8,Ig亚类均为IgG1。结论:制备的杂交瘤细胞株能稳定分泌特异性的抗RAET1G2抗体,并且所分泌的单克隆抗体都能识别天然的RAET1G蛋白,为进一步研究游离性的RAETlG2分子与肿瘤进展的关系以及分析各种肿瘤细胞表面的RAET1G表达情况创造了条件。

人白细胞介素-15 cDNA的克隆及其在大肠杆菌中的表达

从正常人外周血中分离粘附的单核细胞，加入ＬＰＳ刺激４ｈ后提取细胞ｍＲＮＡ反转录获得ｃＤＮＡ第一链，用两对特异引物进行巢式ＰＣＲ扩增出含ＢａｍＨＩ酶切位点的编码人１Ｌ－１５成熟蛋白的ｃＤＮＡ，其大小约３６０ｂｐ。用ＰＥＧ法回收其片段并将其连接到ｐＢＳＳＫ载体的ＳｍａⅠ位点上进行序列分析，结果表明其序列与文献报道一致。然后再将其片段亚克隆插入到ｐＧＥＸ－２Ｔ的ＢａｍＨＩ位点。筛选插入方向正确的克隆，转化大肠杆菌ＪＭ１０９，以１ｍｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ诱导５ｈ收集菌体直接进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ，与阴性对照相比，ＭＷ４４ＫＤ处多出一条带，紫外扫描显示此带占菌体蛋白总量的８．８％。ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ证实此带能够特异地与兔抗人ＩＬ－１５的抗体发生反应。证明ＲＴ－ＰＣＲ所得的人ＩＬ－１５ｃＤＮＡ在大肠杆菌中获得了表达，为进一步探讨人ＩＬ－１５的生物学作用打下基础。

昆虫杆状病毒表达系统表达TCRγ9/δ2-Fc融合蛋白及其生物学功能的初步鉴定

目的建立昆虫杆状病毒表达系统表达TCRγ9/δ2-Fc融合蛋白技术平台并鉴定其表达产物的生物学功能。方法用搭桥PCR获得γ9Fc和δ2(OT3)Fc基因片段,构建成pBACp10ph-γ9/δ2(OT3)-Fc重组质粒,与AcNPV昆虫病毒DNA共转染昆虫sf9细胞,表达TCRγ9/δ2-Fc融合蛋白;Western blot鉴定TCRγ9/δ2-Fc蛋白表达位置;胞内流式细胞仪检测γ9Fc和δ2(OT3)Fc两基因表达效率;蛋白G亲和层析后,SDS-PAGE鉴定蛋白纯度;激光共聚焦扫描显微镜技术和生物传感器技术检测了TCRγ9/δ2-Fc蛋白与SKOV3细胞和MNS蛋白的结合特性。结果成功构建pBACp10ph-γ9/δ2(OT3)-Fc表达载体,经鉴定发现TCRγ9/δ2-Fc蛋白在sf9细胞内表达,但γ9Fc和δ2(OT3)Fc两基因的表达效率有较大差异。纯化得到一定纯度的TCRγ9/δ2-Fc蛋白,并且具有与SKOV3细胞和MNS蛋白结合的特性。结论成功建立昆虫杆状病毒表达系统表达TCRγ9/δ2-Fc融合蛋白的技术平台,表达产物TCRγ9/δ2-Fc可以在体外模拟TCRγδ识别抗原的特性。

肿瘤免疫相关基因治疗

肿瘤免疫相关基因治疗沈永泉，崔莲仙（中国医学科学院基础医学研究所，北京１００００５）肿瘤基因治疗可以分为三类￣［１，２］：（１）肿瘤免疫相关基因治疗（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ－ｒｅｌａｔｅｄＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙｏｆＣａｎｃｅｒ）：主要将与免疫系统功能相关的...

人白细胞介素-15cDNA真核表达载体的构建及其在肺癌细胞中的表达

目的观察人ＩＬ－１５ｃＤＮＡ在腺癌细胞内的表达。方法将人ＩＬ－１５ｃＤＮＡ于ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ位点正向克隆到逆转录病毒载体ｐＬＸＳＮ，构建ｐＬ－ＩＬ－１５－ＳＮ的重组质粒。以Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ介导将该重组质粒转染到人肺鳞癌细胞（ＰＧ细胞系）和小鼠肺腺癌细胞（ＬＡ７９５细胞系）。经Ｇ４１８条件培养筛选，获得阳性细胞克隆。再经ＣＴＬＬ－２细胞增殖法测阳性细胞ＩＬ－１５的表达活性。结果获得３个ＰＧ细胞和４个ＬＡ７９５细胞阳性克隆，ＩＬ－１５活性测定显示其表达水平在２４ｈ内分别在１４２～２０１或１３８～１７８Ｕ／（ｍｌ·１０６细胞）。结论ＩＬ－１５ｃＤＮＡ转导的人和小鼠肺癌细胞可表达有生物学活性的ＩＬ－１５。

注射用胸腺肽研究成果的推广应用

60年代实验证明胸腺是机体细胞免疫的中枢器官。我们实验室1973年开始了胸腺激素的研究,对1972年首见报道的胸腺素(ThymosinF5)的分离方法进行了验证和较大的改良,创建了脐带血E玫瑰花结检测生物活性的方法,而且通过临床协作研究,观察到它对获得性免疫功能低下症有明显的治疗效果,这些结果分别获得卫生部和北京市政府的奖励。至1979年。

不同治疗剂量白细胞介素2对人外周血γδT细胞增殖和表型的影响

目的研究治疗剂量范围内白细胞介素2(IL-2)对T细胞的增殖作用,特别是对人外周血γδT细胞数量和功能亚群的影响。方法采用密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞,在不同浓度IL-2作用下培养2周,利用免疫荧光染色和流式细胞术分析培养前后不同淋巴细胞的表型和比例,采用台盼蓝染色和血球计数法进行细胞计数。结果Vδ1和Vδ2型γδT细胞的4个功能亚群中,CD27+细胞(包括CD27+CD45RA+和CD27+CD45RA-)可以表达淋巴组织归巢受体CCR7,CD27-细胞(包括CD27-CD45RA+和CD27-CD45RA-)不表达CCR7,具有分布于外周组织的潜能;各个γδT细胞的功能亚群均能表达活性相关受体,在丝裂原刺激下可以迅速产生不同水平的细胞毒作用相关效应分子。虽然高剂量IL-2对CD4 T细胞的增殖产生抑制作用,但对γδT的增殖反而有促进作用,增殖的γδT细胞以CD27-CD45RA-的效应细胞为主。结论治疗剂量范围内的IL-2具有刺激人外周血γδT细胞增殖的作用,在基于IL-2的抗肿瘤治疗中可能具有重要的生物学意义。

人B淋巴细胞活化相关新基因的克隆

分离新的与 B细胞活化相关基因。方法采用差异显示反转录 PCR（ DDRT－ PCR）技术对人扁桃体活化和静止 B细胞 mRNA的差异表达进行分析，差异显示的片段经过 Northern杂交验证后，作为探针进行人活化 B细胞 cDNA文库的筛选。结果差异显示分析共获得明显的差异表达的标签序列（ expressed sequence tag, EST） 62条，其中主要在静止 B细胞表达的有 32条，在活化 B细胞表达的有 30条。经 Northern杂交验证，共获得阳性的片段 25条。以在活化 B细胞中高表达的 EST30为探针，经 3轮筛选人活化 B细胞文库后获得 1个新的全长为 2 048 bp的 cDNA克隆。该克隆含有 1个 630 bp的开放读码框。其推断的氨基酸序列 N端与酵母的动力蛋白 KAR3部分同源。结论克隆了 1条可能与 B细胞活化相关的新基因。

TCRγ9/δ2(OT3)-Fc融合蛋白体内抗肿瘤效果研究

目的:研究TCRγ9/δ2(OT3)-Fc融合蛋白在体内抗肿瘤效果。方法:通过同位素99mTc标记技术观察TCRγ9/δ2(OT3)-Fc在荷瘤裸鼠体内的显像和分布,观察TCRγ9/δ2(OT3)-Fc对荷瘤裸鼠肿瘤生长和生存期的影响。结果:在荷瘤裸鼠体内99mTc-TCRγ9/δ2(OT3)-Fc与肿瘤组织有明显的结合,并且其可抑制荷瘤裸鼠肿瘤生长速度,延长小鼠生存期。结论:本研究初步证实TCRγ9/δ2(OT3)-Fc在荷瘤裸鼠体内有一定的抗肿瘤效果,为肿瘤靶向性抗体治疗提供了新的思路。

MICA反应性Vδ1γδT细胞对上皮肿瘤细胞的细胞毒作用

目的研究人类MHCⅠ类链相关基因A(MICA)是否可以在体外诱导Vδ1γδT细胞的扩增,并且对MICA反应性Vδ1γδT细胞的细胞毒作用进行初步研究。方法采用分子克隆技术原核表达并纯化MICA蛋白,使用重组MICA蛋白在体外诱导肿瘤组织中的Vδ1γδ肿瘤浸润T淋巴细胞(TILs),3-(4,5-二甲基噻唑-乙-YL)-2,5-二甲基-四唑溴盐(MTT)法检测MICA反应性Vδ1γδTILs的细胞毒活性。结果原核表达系统pET30表达并纯化了MICA;固相化的MICA蛋白可以诱导肿瘤组织中的Vδ1γδTILs在体外扩增,同时Vδ1γδTILs对MICA+的肿瘤细胞具有明显杀伤活性。结论MICA反应性Vδ1γδT细胞可能是肿瘤过继免疫治疗的新的候选效应细胞。

免疫重建SCID小鼠B淋巴母细胞瘤模型的建立

目的在免疫重建的严重联合免疫缺陷(severecombinedimmunodeficient,SCID)小鼠体内建立人的B淋巴母细胞瘤模型。方法将SCID小鼠随机分为4组,每组7只,分别为:(1)实验组:在每只SCID小鼠的腹腔内接种人外周血单个核细胞(peripheral-bloodmononuclearcells,PBMC)1周后,腹腔接种EB病毒(Epstein-Barrvirus,EBV)悬液;(2)不经任何处理的SCID小鼠对照组;(3)腹腔接种人PBMC的SCID小鼠对照组;(4)腹腔接种EBV悬液的SCID小鼠对照组。每日观察小鼠的健康情况,于免疫重建的第5周解剖各组小鼠,观察腹腔各脏器的肿瘤形成情况,并用HE染色、组织化学以及PCR方法鉴定所长肿瘤的特性。结果4周后,在接种EBV的免疫重建SCID小鼠的腹腔中可形成(35±12.5)mm3大小的肿瘤,多位于肝脏,而对照组均未见有肿瘤生长;HE染色表明,所长的肿瘤均为高分化的B淋巴母细胞瘤;组织化学实验表明,肿瘤细胞均可表达CD19、CD20、CD45RA分子和EB病毒编码的蛋白;PCR检测显示,肿瘤组织的DNA在269bp处出现特异的EBV扩增条带。结论成功建立了免疫重建SCID小鼠的人B淋巴母细胞瘤模型,为研究人类肿瘤免疫提供了一个理想的动物模型。