噬菌体T7溶菌酶基因的克隆

以pBR322及含有噬菌体T7 RNA聚合酶强启动子φ10的pBR322衍生物作为克隆载体,经限制内切酶Ava Ⅱ+HaeⅢ切割的一段噬菌体T7 DNA片段分别克隆到pBR322及其衍生质粒的BamHI位点上。插入的DNA片段为632碱基对。该片段包括噬菌体T7基因3.5和T7 RNA聚合酶弱启动子φ3.8的全部编码序列。已知噬菌体T7基因3.5的功能为产生噬菌体T7溶菌酶,利用氯仿处理检测带有重组质粒的转化子胞内溶菌酶活力。证明两种克隆株整体细胞中,均有溶菌酶存在。用10—20%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检查噬菌体T7基因3.5蛋白带,结果表明T7基因3.5在pBR322衍生质粒中的表达优于pBR322。

噬菌体T7溶菌酶工程菌的构建

将噬菌体T7溶菌酶基因克隆到含有可诱导性启动子LacUV 5的表达载体pAR1206中。在没有诱导剂存在情况下,LacUV 5启动子的转录受到抑制。当带有重组质粒的转化菌生长到适当浓度,向培养液中加入0.4mmol/L IPTG,LacUV 5启动子受到诱导,从而使插入的基因高水平表达,并积累大量具有生物活性的溶菌酶。噬菌体T7溶菌酶在大肠杆菌中表达的产量平均约22mg/L。

工程菌噬菌体T7溶菌酶的纯化和性质

用崔道珊等构建的噬菌体Ｔ７溶菌酶工程菌株，培养物经超声破碎和ＤＥ５２，ＣＭ５２柱层析纯化，我们得到电泳纯的Ｔ７溶菌酶，分子量为１７０００，最适反应ｐＨ为８．０．其热稳定性欠佳，保温３７℃，５ｍｉｎ即丧失酶活２ｌ％。