靶向成纤维细胞活化蛋白通过影响肿瘤相关成纤维细胞的外泌体抑制内皮细胞间质转化

目的探讨特异性抑制成纤维细胞活化蛋白(fibroblast activation protein,FAP)是否能够通过影响肿瘤相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts,CAFs)的外泌体(exosomes,exo)抑制内皮细胞间质转化(endothelial-to-mesenchymal transition,EndMT)并探究其机制。方法提取原代CAFs和癌旁成纤维细胞(peri-tumor fibroblasts,PTFs),收集CAFs-exo和PTFs-exo,特异性FAP抑制剂(3.3 nmol·L^(-1)SP13786)处理CAFs 24 h后收集的外泌体命名为Anti-FAP-exo。将内皮细胞HMEC-1分别以等体积的RPMI 1640、PTFs-exo、CAFs-exo及Anti-FAP-exo孵育并命名为control组、PTF组、CAF组及Anti-FAP组。划痕实验、Transwell侵袭实验、血管生成实验检测各组HMEC-1细胞的迁移、侵袭及血管生成能力;免疫荧光、免疫组化和Western blot检测EndMT相关蛋白表达水平。结果CAF组HMEC-1细胞的迁移、侵袭及血管生成能力较PTF组明显增强,Anti-FAP组HMEC-1细胞迁移、侵袭及血管生成能力较CAF组明显减弱,与PTF组比较无差异。与PTF组相比,CAF组HMEC-1细胞高表达α-SMA、SM22α、p-Stat3和Snail,低表达CD31和VE-cadherin;与CAF组相比,Anti-FAP组HMEC-1低表达α-SMA、SM22α、p-Stat3和Snail,高表达CD31和VE-cadherin。结论特异性抑制FAP会通过影响CAFs外泌体间接抑制血管内皮细胞的迁移侵袭与成管能力,Stat3-Snail-EndMT可能是其潜在机制。

阿霉素通过Stat3-cMyc途径诱导三阴性乳腺癌MDA-MB-468细胞耐药性

目的观察阿霉素(Adriamycin,ADM)对人三阴性乳腺癌MDA-MB-468细胞耐药性的诱导作用并探讨其机制。方法培养人三阴性乳腺癌MDA-MB-468细胞,用不同浓度阿霉素处理细胞24 h后,MTT法检测细胞生长抑制率及细胞对阿霉素的敏感度。免疫荧光染色法检测耐药蛋白ABCG2的表达;免疫印迹法检测Stat3、p-Stat3、转录因子cMyc及耐药蛋白ABCG2的表达水平。结果阿霉素持续刺激4周后,获得的MDA-MB-468/ADM细胞对阿霉素的敏感度明显降低,且耐药蛋白ABCG2的表达明显增加;MDA-MB-468/ADM细胞p-Stat3、cMyc及ABCG2的表达量显著增加;MDAMB-468/ADM细胞培养液中加入WP1066后Stat3磷酸化明显抑制,cMyc及ABCG2的表达水平下调,并且MDA-MB-468/ADM细胞对阿霉素的敏感度明显增强(P<0.05)。结论阿霉素可以通过Stat3-cMyc途径诱导三阴性乳腺癌MDA-MB-468细胞产生耐药性。

SP13786通过CAFs外泌体抑制Stat3-EMT影响肺腺癌细胞A549的迁移侵袭

背景与目的成纤维细胞活化蛋白(fibroblast activation protein,FAP)是肿瘤相关成纤维细胞(cancerassociated fibroblasts,CAFs)的表面标志物之一,与CAFs的恶性表征关系密切,SP13786是FAP的特异性小分子抑制剂。本研究探讨SP13786作用于CAFs后,CAFs外泌体(exosomes,exo)对A549细胞迁移、侵袭的影响与机制。方法原代提取CAFs和癌旁成纤维细胞(peri-tumer fibroblasts,PTFs);MTT实验检测不同浓度SP13786对CAFs增殖的影响;聚合物沉淀法提取PTFs-exo、CAFs-exo以及CAFs+SP13786-exo。将A549细胞设对照组、PTFs组、CAFs组及CAFs+SP13786组并分别以等体积的DMEM、PTFs-exo、CAFs-exo及CAFs+SP13786-exo孵育细胞。激光共聚焦实验检测A549细胞摄取外泌体的情况;免疫荧光、免疫组化和Western blot方法检测α平滑肌肌动蛋白(alpha-smooth muscle actin,α-SMA)、FAP在PTFs和CAFs中的表达及E-cadherin、N-cadherin、Slug、Stat3、P-Stat3在各组A549细胞中的表达;划痕实验和Transwell实验检测各组细胞的迁移和侵袭能力。结果免疫荧光、免疫组化和Western blot结果均显示α-SMA、FAP在CAFs中高表达,在PTFs中低表达(P<0.05),表明从肺腺癌组织和癌旁组织中分别成功获得了CAFs和PTFs。MTT实验测得SP13786对于CAFs细胞的半数抑制浓度(50%inhibitory concentration,IC50)约为3.3 nmol/L。免疫组化和Western blot结果显示与CAFs组相比,CAFs+SP13786组的α-SMA与FAP的表达显著降低(P<0.05),说明抑制FAP可以显著降低CAFs的恶性表征。激光共聚焦结果显示外泌体能够被A549细胞所摄取。划痕实验与Transwell实验显示SP13786可抑制CAFs-exo对A549细胞迁移和侵袭的促进作用(P<0.05)。与CAFs组比较,SP13786组A549细胞E-cadherin表达增多,N-cadherin与Slug表达降低(P<0.05);免疫荧光与Western blot显示SP13786组A549细胞的P-Stat3较CAFs组明显降低(P<0.05),而总Stat3无显著差异。Stat3的特异性抑制剂WP1066明显抑制CAFs组A549细胞上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT),P-Stat3显著降低(P<0.05),而加入WP1066后再加入SP13786-exo,P-Stat3未见进一步减低,EMT的抑制亦未见显著变化(P>0.05)。结论FAP的小分子特异性抑制剂SP13786通过影响CAFs外泌体间接抑制A549细胞的迁移、侵袭,其可能机制是抑制Stat3的磷酸化从而影响A549细胞的EMT。