苏北地区奶牛乳房炎乳汁中微生物菌群结构及多样性调查分析

旨在通过比较苏北地区健康奶牛和乳房炎奶牛乳汁中的微生物菌群结构和多样性,分析不同养殖场奶牛乳腺中的主要常驻菌,为防控奶牛乳房炎的发生提供基础数据和科学依据。针对苏北地区3个规模化奶牛养殖场随机采集137份乳样,采用加州乳房炎检测法筛选健康奶牛和乳房炎奶牛,通过对奶样中细菌的16S rRNA测序分析,揭示该地区奶牛乳房炎的流行趋势。结果表明:该地区3个规模化奶牛养殖场乳房炎的平均阳性率为420%,其中,养殖场A的主要乳房炎致病菌是木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus)、松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)、大肠杆菌(Escherichia coli)和肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae),养殖场B的致病菌主要是肠杆菌科(Enterobacteriaceae)和木糖葡萄球菌,而养殖场C奶牛乳房炎阳性比例少,仅有少量的木糖葡萄球菌。此外,伯克霍尔德菌(Burkholderia)、克雷伯菌(Klebsiella)、链球菌(Streptococcus)和草螺菌(Herbaspirillum)是奶牛乳腺中优势常驻菌。研究表明,16S rRNA测序分析技术能够很好地筛选出乳样中的主要菌属,进而分析优势常驻菌,为防控奶牛乳房炎提供参考。

福建省龙岩市禽致病性大肠杆菌的血清型、毒力因子及耐药研究

本研究对2015年分离自福建省龙岩市的139株禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)的血清型、毒力因子分布及耐药性等进行检测,并对血清型与耐药性、毒力因子分布和耐药性之间的相关性进行分析,以期为APEC的防控提供参考。对139株分离菌株的血清型检测结果表明,O1血清型(11株)、O2血清型(14株)和O78血清型(14株)占全部菌株的28%;对分离菌株毒力基因检测结果表明,4%和7.1%的菌株检测到papC基因和vat基因,14.3%和19.3%的菌株检测到aat A基因和cva/cvi基因。而iuc D(82%)、tsh(59%)、iss(55%)和irp2(44.6%)基因在分离菌株中具有较高的检出率;药敏实验结果表明,分离株存在多重耐药性,99%以上分离菌株对红霉素、克林霉素和利福平耐受,86%的分离菌株对10种以上抗生素耐受,57.3%的菌株对13种药物都耐受;对血清型、耐药性与致病性之间的分析结果表明,分离的O1、O2和O78血清型的菌株,其中50%的菌株是含有5种以上毒力基因的强毒株,且在分离的含有5种以上毒力基因的强毒株中,50%的菌株对13种抗生素耐受,90%的菌株对10种以上药物耐受。

布鲁菌半胱氨酸水解酶在甲硫氨酸循环中的催化活性研究

[目的]细菌的sah H基因编码S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(Sah H),该酶参与细菌的甲硫氨酸循环(AMC),调控细菌的多种生理功能。[方法]通过构建重组表达质粒p ET28a-Bru-sah H和p ET28a-Pse-sah H,分别表达布鲁菌(Brucella abortus)S2308株和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)PAO1株的Sah H重组蛋白Bru-Sah H和Pse-Sah H。将纯化后的Bru-Sah H、Pse-Sah H以及我们前期表达纯化的禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli,APEC)的Pfs和Lux S蛋白,分别在体外催化S-腺苷同型半胱氨酸(SAH),通过对产物同型半胱氨酸(HCY)的浓度测定,评价不同重组蛋白的催化活性,并对催化底物时产生的自诱导分子2(AI-2)活性进行检测。[结果]Bru-Sah H和Pse-Sah H分别催化1 mmol·L-1SAH生成38和47μmol·L-1HCY,而APEC的Pfs和Lux S蛋白能催化相同浓度的SAH产生401μmol·L-1HCY。运用哈维弧菌BB170检测上述底物的AI-2活性,结果表明只有同时采用AEPC的Pfs和Lux S蛋白催化SAH,才能形成有活性的AI-2分子,而Bru-Sah H和Pce-Sah H均不能催化SAH形成活性AI-2分子。[结论]Bru-Sah H能催化SAH生成HCY,为进一步研究sah H在布鲁菌感染过程中的作用提供依据。

8株鸭疫里默氏杆菌安徽分离株的生物学特性分析

鸭疫里默氏杆菌病是由鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)感染引起的主要发生于鸭的一种慢性或急性、高度接触性传染病。本研究开展了2017年分离自安徽的8株RA菌株的生物学特性研究。血清型检测结果表明,8株RA中6株为血清10型,2株为血清15型;对24种抗菌药物敏感性检测结果表明,RA对阿莫西林、头孢他啶和头孢吡啶敏感,对洛美沙星和阿奇霉素耐药;生物被膜检测结果表明,8株菌株中有7株为强生物被膜形成株,1株为弱生物被膜形成株;运用real-time PCR对强生物被膜形成菌株AH-1和弱生物被膜形成菌株AH-35中的生物被膜形成相关的5个基因进行检测,结果表明,与AH-35菌株相比,AH-1中的Riean_0023、Riean_1039和Riean_1564基因的转录水平均显著上调(p<0.01)。本研究为安徽省RA的防控提供参考。

鸭疫里默氏杆菌pfs基因的克隆表达及单克隆抗体制备

将鸭疫里默氏杆菌的pfs基因进行原核表达,重组蛋白经纯化后作为抗原免疫BALB/c小鼠。经过3次免疫后,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合,利用间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞株。通过间接ELISA法测定腹水效价、Western blot法检测其免疫反应性,并鉴定抗体的亚型。重组蛋白SDS-PAGE检测结果验证得到26 k Da Pfs蛋白,免疫小鼠后最终获得1株阳性杂交瘤细胞株,命名为2E2E6,为Ig G1亚类,间接ELISA法检测腹水效价为1:64 000。Western blot结果表明制备的单克隆抗体具有良好的免疫反应性。本研究成功制备了Pfs的单克隆抗体,为进一步研究Pfs在鸭疫里默氏杆菌中的作用提供了参考。

上海市鸡源单增李斯特菌株分子流行病学调查

为了解上海市大型超市售卖鸡肉中单增李斯特菌的污染情况,本研究于2018年7月从上海市的多个超市中随机采集冷藏鸡翅样品270份,并对分离菌株的耐药性、血清型及生物被膜形成能力进行测定。通过常规细菌学和分子鉴定方法共确定38株单增李斯特菌,总分离率为14.07%;对分离株采用PCR法进行血清学分型,结果显示分离株以血清型1/2a(3a)型为主(63.16%,24/38),血清型1/2c(3c)次之(36.84%,14/38);K-B法药敏试验结果显示分离菌株对头孢曲松的耐药性最高(52.63%),对诺美沙星(18.42%)和四环素(15.79%)次之,对头孢噻吩、庆大霉素、氨苄西林和阿莫西林的耐药率较低,均为5.26%,对新霉素、大观霉素、卡那霉素和氯霉素的耐药率最低,均为2.63%;所有分离株对诺氟沙星、环丙沙星和链霉素这3种药物均敏感,13.16%分离株表现出多重耐药现象,最多可耐受6种抗生素;结晶紫染色法测定生物被膜形成能力,结果表明所有菌株均能形成生物被膜,且84.21%(32/38)的分离菌株能形成较强生物被膜,其中1/2a(3a)和1/2c(3c)血清型分别占59.37%和40.63%。本研究结果表明上海市鸡肉源食品中单增李斯特菌污染情况比较严重,主要流行1/2a(3a)血清型,耐药模式多样且日趋严重,大多菌株具有强生物被膜形成能力,提示应进一步加强对动物源性食品中单增李斯特菌的监控,以降低食品安全问题带来的风险。

禽致病性大肠杆菌luxS和rbsC双基因缺失株的构建及其生物特性分析

禽致病性大肠杆菌(APEC)能引起家禽严重的呼吸系统和全身性疾病,由于APEC耐药菌株的不断出现迫使新型抗菌方式的研发迫在眉睫。本研究旨在评价APEC的luxS和rbsC双缺失的突变株作为减毒疫苗候选株的潜力,通过在APEC分离株DE17的单基因缺失株DE17ΔluxS的基础上,利用Red重组系统构建双基因缺失株DE17ΔluxSΔrbsC,并对其生物学特性进行了分析。结果显示:rbsC的缺失不影响DE17ΔluxS的生长特性和生物被膜形成能力,但运动性显著降低;与DE17ΔluxS相比,DE17ΔluxSΔrbsC的黏附能力和入侵能力分别降至46.92%和28.78%;半数致死量(LD50)结果显示,毒力下降了115.5倍;肝脏、脾脏和血液中的载菌量分别下降了3.63倍、79.20倍和2124.41倍。根据以上结果推测,rbsC基因的缺失会进一步降低DE17ΔluxS的毒力,本文为评价DE17ΔluxSΔrbsC株减毒机制提供参考。

贝氏隐孢子虫及其与大肠杆菌共感染对雏鸡肠道菌群的影响

为调查贝氏隐孢子虫单独以及与禽致病性大肠杆菌合并感染对雏鸡肠道菌群的影响,将1日龄SPF级雏鸡分为隐孢子虫单独感染组(灌胃隐孢子虫1×10^(6)个/只)、隐孢子虫和大肠杆菌共感染组(肌注大肠杆菌2×106 CFU/只,同时灌胃隐孢子虫1×10^(6)个/只)与健康对照组,分别于接种后第3、9、15、21和27天采集新鲜粪便,提取DNA后进行16S rRNA高通量测序及生物信息学分析。结果显示,3组雏鸡肠道微生物相对丰度最高的门为厚壁菌门,其次为拟杆菌门和变形菌门。多样性分析表明,2组感染雏鸡的肠道菌群多样性降低,但隐孢子虫单独感染组较共感染组先恢复。从属水平分析发现,与健康对照组比较,共感染组的乳杆菌属丰度明显降低(P<0.05),而大肠/志贺菌属则显著升高(P<0.05),两者此消彼长。2感染组雏鸡肠道中的布劳特菌属和瘤胃球菌属伴随雏鸡日龄增长呈上升趋势,但相比健康对照组绝对丰度较低。以上结果表明,大肠杆菌的共感染可加剧隐孢子虫感染造成的雏鸡肠道微生物多样性和菌群结构的变化,这可能与采食量的改变以及对免疫力和代谢功能的影响有关。

氧化型辅酶NAD^+及布氏杆菌SahH活性位点对SahH催化活性的影响

[目的]本文旨在鉴定影响布氏杆菌S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(S-adenosylhomocysteine hydrolase,SahH)催化S-腺苷同型半胱氨酸(S-adenosylhomocysteine,SAH)产生同型半胱氨酸(homocysteine,HCY)的催化活性位点。[方法]将表达载体pET28a-Bru-sahH转化大肠杆菌BL21中,表达、纯化布氏杆菌SahH(Bru-SahH)蛋白,分析辅酶NAD+、磷酸化修饰及活性位点对Bru-SahH催化活性的影响。[结果]添加NAD+后,Bru-SahH的催化活性降低85.6%;对Bru-SahH质谱分析表明,其444位丝氨酸为可能的磷酸化位点,对该位点突变后Bru-SahH催化SAH形成HCY的活性降低85.5%;生物信息学分析表明,Bru-SahH的337位和338位氨基酸为其活性位点,分别对上述2个位点进行单突变和双突变,突变后的Bru-SahH催化活性降低90.8%以上。[结论]Bru-SahH的337、338和444位氨基酸是其催化活性位点,添加外源性NAD+可抑制其催化活性。

禽致病性大肠杆菌脂多糖核心型分布与毒力基因的相关性分析

【目的】大肠杆菌脂多糖(LPS)核心型根据其化学结构的不同分为5种,即R1、R2、R3、R4和K12。通过对禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)安徽、江苏、上海和河南等省市分离株的脂多糖核心型分布情况的研究,分析其与大肠杆菌主要毒力基因之间的潜在联系,以期为APEC的研究和防治提供参考。【方法】对分离到的76株APEC,利用PCR方法开展对LPS核心型分型鉴定和毒力基因检测;分析LPS核心型的分布和毒力基因、致病性之间的相关性。【结果】在76株APEC分离株中,68.4%(52株)为R1核心型,15.8%(12株)为R3型,11.8%(9株)为R4型,3.9%(3株)为R2型,未检测到K12核心型。毒力基因鉴定结果中yijp、mat、fim C、ibe B和omp A的检验阳性率均达到90%以上,可作为APEC的保守基因。其中LPS核心型R1与neu C、cva/cvi、irp2均具有显著正相关性(P<0.05),R3与iro N、irp2均具有显著负相关性(P<0.05),R4核心型与aat A显著正相关(P<0.05)。【结论】APEC的LPS核心型主要为R1。LPS核心型对部分毒力基因分布具有显著影响。

2020年国内部分地区奶牛乳腺炎源大肠杆菌的分子流行病学调查

本研究对来自国内11个地区136份乳腺炎乳样开展了大肠杆菌的生物学特性研究。通过大肠杆菌phoA特异性鉴定引物对乳房炎乳样进行大肠杆菌分离与鉴定,采用K-B法对分离株进行药敏检测。建立3体系三重PCR检测方法,利用大肠杆菌9种毒力基因对分离株进行检测。通过PCR检测chuA、yjaA和TspE4.C2,对分离株进行进化分群鉴定。结果显示:136份乳腺炎乳样中共分离到61株大肠杆菌,阳性率为44.85%。分离株对头孢拉定、氨苄西林、四环素耐药率相对较高,分别为37.70%、32.78%和26.22%。分离株中毒力基因ompA和traT携带率较高(98.36%和75.40%),其次为CNF1(54.09%)、irp2(47.54%)和iucD(32.78%),sitD和chuA携带率较少(14.75%和13.11%),但ST2和hlyA基因均未检出。分群结果显示分离株以A群占(67.21%)和B1群(19.67%)为主,D群(8.19%)和B2群(4.91%)较少。本研究为奶牛乳腺炎源大肠杆菌的防控提供数据参考。

wzzE不影响禽致病性大肠杆菌雏鸭分离株LPS的表型

【目的】wzz参与很多革兰氏阴性菌O抗原的合成,并对细菌的致病性具有调控作用。在禽致病性大肠杆菌（Avian pathogenic Escherichia coli,APEC）中,存在Wzz蛋白超家族基因wzz E,目前尚未开展该基因对APEC脂多糖（LPS）的合成及致病作用研究,因此本研究开展了wzz E对APEC LPS合成以及生物学特性影响的研究。【方法】通过构建APEC DE17株的wzz E缺失株,开展对野生型和缺失株的LD50、黏附与入侵DF-1细胞、脂多糖表型及内毒素毒价等相关生物学特性的影响研究。【结果】结果表明,缺失wzz E的APEC,不影响细菌的生长特性。野生型、缺失株及回复株的LPS表型无明显差异。DE17Δwzz E与DE17的黏附与入侵结果无显著差异。血清型鉴定结果表明,缺失wzz E,不影响细菌的血清型。内毒素毒力检测结果DE17、DE17Δwzz E及CΔwzz E内毒素的毒价一致,为4×10~5 EU/mg。对7日龄樱桃谷鸭进行攻毒,测定各菌株的LD50,结果表明,与野生型相比,DE17Δwzz E缺失株毒力下降了10倍。【结论】wzz E缺失对LPS的表型无显著影响,但wzz E参与APEC的致病过程,然而wzz E对APEC毒力的调控机制仍有待进一步研究。

制备禽致病性大肠杆菌菌蜕的三种方法比较

菌蜕(Bacterial ghosts)是一种只含有细菌内、外膜结构的细菌空壳,可作为新型疫苗和传递载体。本研究通过3种方式制备禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenicity Escherichia coli,APEC)分离株DE17的菌蜕,评价不同的菌蜕制备方法。结果表明,利用噬菌体Phi X174的裂解基因E构建的溶菌质粒pBV220-E制备DE17菌蜕,对DE17菌株裂解率可达99.9%,扫描电镜观测结果表明,在DE17两端或中部形成可见的跨膜孔道,呈现典型的菌蜕结构。利用合成的细胞穿透肽MAP(KLALKLALKALKAALKLA)作用于DE17制备菌蜕,结果表明,10μmol/L的MAP可实现对OD_(600)=0.1的DE17完全灭活,扫描电镜虽未看到明显的跨膜孔道,但细菌的膜结构呈现沟壑状,而构建的可表达MAP的溶菌质粒pBV220-MAP并不能实现对DE17的裂解作用。本研究通过比较分析不同APEC菌蜕的制备方式,为进一步研究菌蜕疫苗和提高菌蜕疫苗的生物安全性提供参考。

酰基高丝氨酸内脂合成酶LasI对禽致病性大肠杆菌生物学特性的影响

【背景】禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli, APEC)是禽类主要病原菌之一,群体感应(Quorumsensing,QS)系统可通过信号分子调控其生物学特性。在APEC中信号分子AHL对其生物学特性的影响目前尚不清楚。【目的】研究信号分子AHL对APEC生物学特性的影响。【方法】将含铜绿假单胞菌酰基高丝氨酸内脂合成酶(Acyl-homoserine-lactone synthase,lasI)基因的表达质粒转化至APEC菌株DE17中,构建重组菌株DE17-lasI,利用LasI在DE17中合成AHL。比较野生株和重组菌株产生AHL信号分子、生长特性、生物被膜形成能力、运动性以及耐药性等生物学特性的差异;运用Real-timePCR技术,比较野生株和重组菌株中与生物被膜形成、运动性以及毒力因子相关基因的转录水平。【结果】对重组菌株AHL信号分子检测表明,DE17-lasI能够产生AHL信号分子,与野生株DE17相比,DE17-lasI生物被膜形成能力和运动性显著降低(P<0.01),但其生长特性和耐药性无显著变化(P>0.05);Real-time PCR检测结果表明,重组菌株的毒力因子fimH转录水平上调了58.8倍,而ompA、iss分别下调了95.4%、77.3%。与生物被膜形成相关基因agn43下调了75%,鞭毛合成基因flhA下调了80.8%。此外,AHL受体sdiA的转录水平上调了19.8倍。【结论】转化lasI至APEC中,能促进其在APEC中合成信号分子AHL,并显著影响APEC的部分生物学特性,为进一步探讨AHL型群体感应系统对APEC的调控作用提供参考。

yeaI基因对奶牛源大肠杆菌NJ17生物学特性的影响

c-di-GMP是细菌中广泛存在的第二信使,可通过效应蛋白参与调控细菌的生物被膜形成、运动性和毒力等生物学特性。YeaI因含有能结合c-di-GMP分子的EGEVF基序,可能作为c-di-GMP效应蛋白发挥作用。【目的】研究yeaI基因缺失对奶牛源大肠杆菌临床分离株NJ17生物学特性的影响。【方法】构建NJ17的yeaI缺失株(NJ17△yeaI)及回复株cNJ17△yeaI,分析yeaI对NJ17生物学特性(如生长特性、生物被膜形成能力和对小鼠乳腺上皮细胞(EpH4-Ev)的黏附)的影响。【结果】成功构建NJ17的yeaI缺失株(NJ17△yeaI)及其回复株(cNJ17△yeaI);与野生株NJ17相比,缺失株NJ17△yeaI生长特性及耐药性无显著变化,生物被膜形成能力显著下降,运动性显著升高(P<0.05);透射电镜检测结果表明,yeaI缺失影响NJ17菌毛和鞭毛的形成;实时定量PCR(qPCR)结果显示,yeaI基因显著抑制NJ17鞭毛基因filG和motB的转录水平(P<0.05);血清杀菌实验表明,yeaI缺失能显著增强其抵抗血清杀菌作用(P<0.05);对EpH4-Ev细胞黏附实验表明,yeaI缺失对NJ17黏附性无显著影响(P>0.05)。【结论】yeaI对奶牛源大肠杆菌NJ17的生物学特性具有重要的调控作用。