基因工程小分子抗体研究进展

自从七十年代杂交瘤技术问世以来,人们获得了多种抗肿瘤的单克隆抗体(McAb),用单克隆抗体为载体,接上药物、毒素或放射性同位素而形成免疫交联物,用于肿瘤的导向诊断和导向治疗,一直是一个极有吸引力的前景。McAb标记上同位素用于肿瘤定位诊断的实验与临床研究取得了令人鼓舞的成绩,但导向治疗的临床研究结果却远远低于人们的期望值,主要原因有以下两方面。首先是所用的小鼠单位往往导致人抗鼠抗体反应,一次注射抗体有50％的病人产生抗抗体;

骨癌痛大鼠脊髓背角KCC2的表达及可能机制

目的研究骨癌痛大鼠脊髓背角钾离子-氯离子联合转运体2(potassium-chloride cotransporter2,KCC2)的表达变化及其可能机制。方法采用大鼠胫骨骨髓腔接种Walker256肿瘤细胞建立胫骨癌痛模型。观测种瘤前后大鼠机械缩足反射阈值(mechanical withdrawl thresthold,MWT)和脊髓背角KCC2表达水平的变化,观察痛敏形成前鞘内预注射酪氨酸蛋白激酶B(tyrosine protein kinase B,TrkB)中和抗体阻断脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BD-NF)-TrkB途径对KCC2表达和机械性痛觉超敏的影响。结果大鼠种瘤后6～12d,MWT明显下降(P<0.01),出现明显的机械性痛敏,脊髓背角KCC2蛋白水平进行性降低(P<0.01);鞘内预注射TrkB中和抗体的骨癌痛大鼠,其脊髓KCC2表达水平和MWT明显高于注射IgG和不作处理的骨癌痛大鼠(P<0.01)。结论脊髓背角的KCC2可能参与了骨癌痛的发生发展,而BDNF-TrkB途径可能介导了该作用。

3种脂质体介导法转染大鼠小胶质细胞的比较研究

目的以LipofectamineTM2000为对照,研究GenEscortTMⅠ和GenEscortTMⅢ在大鼠小胶质细胞中的转染效率及毒性。方法分别采用LipofectamineTM2000、GenEscortTMⅠ和GenEscortTMⅢ为载体,转染绿色荧光蛋白(GFP)标记的siRNA进入大鼠小胶质细胞。计算转染效率。采用磺基罗丹明B法(SRB)分析转染试剂对细胞的毒性,并研究细胞传代次数、接种密度、脂质体与siRNA的比例及脂质体-siRNA复合物形成时间等对脂质体转染效率的影响。结果 2～3次细胞传代,接种密度为1×105(24孔板)、脂质体与siRNA比例为1∶2.5、脂质体-siRNA复合物形成时间分别为30 min或15 min,转染效率最高。3种不同脂质体介导的GFP-siRNA转染的大鼠小胶质细胞内均有GFP表达,其最佳转染比例下转染效率比较为LipofectamineTM2000组>GenEscortTMⅠ组>GenEscortTMⅢ组(P<0.01);3种转染剂的细胞毒性比较为LipofectamineTM2000组>GenEscortTMⅠ组>GenEscortTMⅢ组(P<0.01)。结论阳离子脂质体GenEscortTMⅠ比LipofectamineTM2000细胞毒性低,转染效率可,是一种更为理想的小胶质细胞基因转染载体。

针对小胶质细胞上BDNF表达的siRNA筛选及其抑制效应检测

目的筛选有效抑制小胶质细胞上脑源性神经生长因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)表达的小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)序列,并观察其对小胶质细胞活性标记物OX-42表达的调节作用。方法设计并合成针对BDNF的siRNA3对(siRNA1588,siRNA283,siR-NA232)及一条带绿色荧光标记的通用阴性对照FAM-siRNA。在LipofectamineTM 2000介导下转染小胶质细胞。分别采用Real-TimePCR及Western blot方法测定并比较其抑制率;采用磺基罗丹明B法(sulforhodamine B,SRB)分析转染复合物的细胞毒性。同时采用免疫荧光组织化学结合共聚焦显微镜观察BDNF和OX-42的表达情况。结果①与阴性对照组及siRNA283、siRNA232相比,BDNFsiRNA1588(50μmol·L-1,脂质体与siRNA比例1∶3)干扰小胶质细胞后,其mR-NA和蛋白的相对表达量最低(P<0.01)。②Lipofectami-neTM 20008μl复合50μmol·L-1siRNA(脂质体与siRNA比例为1∶3),不仅细胞毒性低而且转染效率高(P<0.01),为最佳转染条件。③BNDF和OX-42存在共表达;且siR-NA1588作用后OX-42的平均光密度值(IOD/area)明显降低(P<0.01)。结论①siRNA1588对小胶质细胞上BDNF表达的抑制效果最大。②BDNF在小胶质细胞的活性调节中具有重要作用。

替莫唑胺诱导的人脑胶质瘤耐药细胞系的建立及其耐药性逆转

目的 建立对替莫唑胺（temozolomide,TMZ）耐药的胶质瘤细胞系并探讨其逆转方式。方法 通过体外分步诱导法使人脑胶质瘤U251细胞对TMZ产生耐药性;利用细胞集落形成实验检测U251/TR的耐药指数;采用MTT法检测O^6-BG对TMZ的细胞毒反转效应。结果 历经6个月建立了对TMZ耐药的U251/TR,在0.25-16μg/mlTMZ培养液中,其细胞形成相对率是未诱导组U251细胞的4-11倍;U251/TR对TMZ的耐药指数约为4;MGMT抑制剂O^6-BG可明显增加TMZ对耐药系的细胞毒作用。结论 通过分步诱导法在体外建立了一株对TMZ耐药的细胞系,其耐药性可被O^6-BG成功地逆转成药敏细胞。

大鼠鞘内注射MCP-1中和抗体缓解骨癌痛

目的观察脊髓趋化因子单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1,MCP-1,或CCL2)在骨癌痛大鼠中的可能作用。方法大鼠胫骨骨髓腔接种Walker256肿瘤细胞建立骨癌痛模型。观测造模前、后大鼠机械性痛觉超敏Von Frey阈值并观察造模后d 10～12,鞘内给予MCP-1中和抗体对大鼠Von Frey阈值和脊髓小胶质细胞激活标志物(ox-42)表达的影响。结果大鼠种瘤后6～12 d,机械性痛觉超敏Von Frey阈值进行性下降(P<0.01);与对照组相比,鞘内给予MCP-1中和抗体后,脊髓ox-42的表达水平明显降低(P<0.01),Von Frey阈值的明显升高(P<0.01)。结论大鼠鞘内注射MCP-1中和抗体缓解骨癌痛,其机制可能与抑制小胶质细胞的激活相关。

人脑胶质瘤c DNA文库的构建

本室曾制备得到两株单克隆抗体,分别特异地针对两种胶质瘤相关抗原-47kD和180kD的膜糖蛋白。为了阐明这两种胶质瘤相关抗原的生物化学本质及其在正常胶质细胞向恶性转化过程中可能起的作用,我们构建了一个λgtll表达型的人脑胶质瘤cDNA文库,以便用上述单克隆抗体作为探针,从该文库中筛选出与之对应的胶质瘤相关抗原的cDNA克隆。现将建库工作简述于下。

胶质瘤组织中DNA修复基因MGMT启动子区过甲基化研究

背景与目的:O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(O6-methylguanine-DNAmethyltransferase,MGMT)是肿瘤细胞产生亚硝脲药物抗药性的分子基础。启动子区过甲基化而导致MGMT基因的转录失活,影响MGMT蛋白表达。本研究探索了胶质瘤组织中MGMT基因启动子区过甲基化状态及其与MGMT蛋白表达的关系。方法:采用甲基化特异性聚合酶链反应分析胶质瘤组织中MGMT基因启动子区过甲基化状态,同时采用免疫组织化学法分析胶质瘤组织中MGMT蛋白表达情况。结果:在27例胶质瘤患者的肿瘤组织标本中,18例MGMT蛋白表达呈阳性的胶质瘤组织中7例MGMT基因启动子甲基化,阳性率为38.9%;9例MGMT蛋白表达呈阴性的胶质瘤组织中7例MGMT基因启动子甲基化,阳性率为77.8%(P<0.05)。结论:MGMT基因启动子区的甲基化状态与MGMT蛋白的表达相关。MGMT基因启动子过甲基化,MGMT蛋白表达较低;MGMT基因启动子去甲基化,MGMT蛋白表达较高。

用λgt11载体构建人脑胶质瘤基因文库

自人脑胶质瘤手术标本中提取mRNA,逆转录合成cDNA,在T_4DNA 连接酶作用下,与一头是平末端,另一头是EcoR I 粘性末端、内含Not I 切点的插头相连,经T_4多聚核苷酸激酶磷酸化后,再与脱磷酸处理过的λgt11 臂连接,形成重组λgt11DNA。体外包装,构建了一个库容量含1.02×10~6重组子的人脑胶质瘤cDNA 基因文库。克隆效率为1.08×10~7pfu/μg cDNA。重组百分比为96.2%。

脑胶质瘤组织中R132H突变型hIDH1基因双顺反子真核表达载体的构建及鉴定

目的以pcDNA3.1(+)为骨架,构建并鉴定人脑胶质瘤组织中含R132H突变的人源异柠檬酸脱氢酶1基因(hIDH1R132H)和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)序列的双顺反子真核表达载体。方法以内部核糖体进入位点(IRES)/EGFP片段为模板,扩增出IRES/EGFP片段,并在5'末端引入3×Flag标签;通过PCR介导的定点突变法,以pCMV-sports6-hIDH1为模板,扩增hIDH1R132H基因片段,并在3'末端引入3×Flag标签;通过PCR连接两种产物后经双酶切定向克隆入pcDNA3.1(+)骨架;转化大肠杆菌后挑取阳性克隆,提取质粒进行PCR检测及基因序列测定。结果 PCR检测7个菌落中有6个阳性克隆,DNA测序发现引入了hIDH1基因。结论成功构建了双顺反子真核表达载体pcDNA3.1(+)-hIDH1R132H/3×Flag/IRES/EGFP,为研究人胶质瘤组织中R132H突变的作用机制奠定了基础。

鞘内注射TDAG8的siRNA对大鼠骨癌痛的缓解作用

目的观察鞘内注射T细胞死亡相关基因8(T celldeath-associated gene 8,TDAG8)的小干扰RNA(small inter-fering RNA,siRNA)对骨癌痛大鼠机械性痛觉过敏以及脊髓TDAG8表达的影响。方法通过将Walker256肿瘤细胞接种在大鼠左侧胫骨骨髓腔内建立骨癌痛模型。观察接种肿瘤前后大鼠机械缩爪反射阈值(paw withdrawl threshould,PWT)和脊髓TDAG8表达水平的变化;并进一步观察痛觉过敏形成后鞘内注射TDAG8的siRNA对大鼠PWT和脊髓TDAG8表达的影响。结果大鼠接种肿瘤后6～18 d,PWT明显下降(P<0.01),脊髓TDAG8的表达明显升高(P<0.01);与对照组相比,鞘内注射siRNA的骨癌痛大鼠,其PWT明显增高(P<0.05),脊髓TDAG8表达水平明显降低(P<0.01)。结论脊髓部位的TDAG8可能参与了大鼠骨癌痛的形成和发展,鞘内注射其siRNA可以通过干扰脊髓TDAG8的表达而具有疼痛缓解作用。

耐药基因蛋白在人脑胶质瘤组织中的表达

背景与目的:化疗耐药与肿瘤细胞表达耐药基因有关,本研究检测人脑胶质瘤中耐药基因的蛋白表达,为今后临床制定个体化化疗方案提供依据。方法:采用免疫组织化学二步法,检测53例人脑胶质瘤标本及6例正常脑组织中P-糖蛋白(P-gp)、肺癌耐药蛋白(LRP)、谷胱苷肽转移酶(GST-π)和六氧甲基鸟嘌呤 DNA甲基转移酶(MGMT)的蛋白表达。结果:在正常组织中仅有1例P-gp阳性表达,其余三个基因的蛋白表达为阴性,在人脑胶质瘤标本中,P-gp、LRP、GST-π和MGMT的蛋白表达的阳性率分别是32.1%、43.4%、 43.4%和50.9%,LRP和GST-π的蛋白表达率与胶质瘤的病理分级之间有相关性。结论:P-gp、LRP、GST-π和MGMT在人脑胶质瘤中均有较高表达率,LRP和GST-π的表达和胶质瘤的恶性程度有关,联合测定多种耐药基因的表达对制定化疗方案和预后判断有参考价值。

人脑胶质瘤mRNAs的分离纯化及其cDNAs合成

采用异硫氰酸胍/氯化铯超离心法,从人脑恶性胶质瘤手术标本中抽提总 RNA;经两轮Oligo(dT)—cellulose 亲和层析纯化得到 mRNAs。Northern 转移印迹分析表明:mRNAs 无降解,完整性好。以此为模板,经反转录,合成得到双链 cDNAs 分子。cDNA 第1条链的反转录效率为36.4%,第2条链的合成效率为80.8%。

转染XRCC3基因的人脑胶质瘤细胞增加烷化剂类抗癌药耐药性

我们既往的研究表明,在人上皮肿瘤细胞中,XRCC3基因的表达水平同肿瘤细胞对美法仑和顺铂的耐药密切相关,提示XRCC3基因在其中起关键作用。为进一步研究XRCC3基因在脑胶质瘤细胞耐药中的作用,我们选用低水平表达XRCC3基因的人脑胶质瘤细胞SKI-1,将其过度表达XRCC3,研究其耐药性的变化。方法:采用脂质体方法将已插入XRCC3基因的pcDNA3.0表达载体转染人脑胶质瘤细胞SKI-1,G418筛选,得到稳定高表达XRCC3的细胞克隆,转染pcDNA3.1空载体作为对照,用Westem blot方法证实。采用改良的sulforhodamine B(SRB)Colorimetric抗癌药筛选法,对稳定表达XRCC3基因和空载体的SKI-1细胞进行细胞毒试验。结果:XRCC3细胞能稳定地高表达XRCC3蛋白,较MOCK细胞高4倍。XRCC3细胞对顺铂和美法仑的耐药性明显较MOCK细胞增强,分别增加了1.8和2.3倍;对BCNU的耐药性无明显增加。结论:XR-CC3基因在人脑胶质瘤细胞对DNA交链剂耐药中起重要作用。

HK,KK,因子Ⅻ对单核细胞粘附的影响

用3H-TdR标志U937细胞培养于24孔板，在HK，KK和因子Ⅻ作用下，观察U937细胞的粘附情况。结果显示，HKa和高浓度KK抵制U－PA引起的单核细胞浸润，因子Ⅻ双促进单核细胞粘附。提示接触激活系统是U—PA的重要调节因素。

14种药用植物抗肿瘤筛选初报

报道了利用人脑胶质用体外培养细胞系５ＨＧ－４４筛进１４种药用植物的初步结果，其中钢钻ＭａｐｐｉａｎｔｈｕｓｉｏｄｏｉｄｅｓＨａｎｄ。Ｍａｚｚ，和倒吊笔ＷｒｉｇｈｔｉａｐｕｂｅｓｃｅｎｓＲ．Ｂｒ在体外具有较好的抗肿瘤活性，两者的半数抑制浓度ＩＣｓ０（４溶性组分μｇ／ｍｌ）分别为３２和２。

PIK3C3 siRNA-pool对大鼠PC12细胞PIK3C3及P62/SQSTM1表达的影响

目的探讨磷脂酰肌醇激酶3(PIK3C3)小干扰RNA(siRNA)-pool对大鼠PC12细胞PIK3C3及P62/SQSTM1表达的影响。方法将处于对数生长期的PC12细胞随机分为正常组、载体组、阴性对照组及siRNA 25、50、100 nmol/L组。正常组常规培养,其余组均给予载体Lipofectamine2000转染;在转染的同时,阴性对照组加入200 pmol/L FAM-siRNA;siRNA 25、50、100 nmol/L组采用siRNA-pool法分别加入含50、100、200 nmol/L siRNA。各组转染24 h时,采用MTT法检测细胞存活率,采用RT-PCR法检测PIK3C3 mRNA相对表达量;转染48 h时,采用免疫细胞化学法检测P62/SQSTM1表达。结果转染24 h时,正常组、载体组、阴性对照组及siRNA 25、50、100nmol/L组细胞存活率分别为100%、(98.4±1.7)%、(99.7±2.4)%、(104.3±2.8)%、(101.6±5.1)%、(96.9±1.9)%,组间比较P均>0.05;PIK3C3 mRNA相对表达量分别为1、1.01±0.11、0.93±0.07、0.85±0.06、0.78±0.03、0.65±0.04,siRNA 50 nmol/L组PIK3C3 mRNA相对表达量均低于正常组及载体组,siRNA 100 nmol/L组均低于其他各组,组间比较P<0.05或<0.01。正常组及siRNA 100 nmol/L组P62/SQSTM1表达光密度值分别为0.038±0.001、0.054±0.004,组间比较P<0.01。结论 PIK3C3 siRNA-pool可抑制PC12细胞PIK3C3表达,促进P62/SQSTM1蓄积。

DKK1在胶质瘤中的表达分析及其与肿瘤恶性程度的相关性

背景与目的:DKK基因在胶质瘤中的表达及意义尚不清楚,本研究检测分析胶质瘤中DKK1的表达情况及探讨与胶质瘤级别之间的关系。方法:ELISA、免疫组织化学检测培养细胞株/系、脑脊液、血清和胶质瘤组织标本中的蛋白表达,半定量RT-PCR检测DKK1胶质瘤培养细胞中培养细胞株/系、胶质瘤组织标本基因表达,统计不同级别胶质瘤间DKK1表达的差异。结果:ELISA检测结果示高级别胶质瘤细胞组中DKK1蛋白量显著高于低级别胶质瘤细胞及正常对照组(P<0.05)。脑脊液中胶质瘤组DKK1含量显著高于神经系统良性肿瘤组及正常对照组;血清中胶质瘤组、神经系统良性肿瘤组及正常对照组之间DKK1含量差异均未见统计学意义。免疫组织化学结果显示胶质瘤组织中DKK1阳性率(91.5%,43/47)高于正常脑组织中阳性率(18.1%,2/11),且DKK1在胶质瘤组织中的表达与肿瘤病理分级呈正相关。半定量RT-PCR结果显示胶质母细胞瘤细胞株/系的DKK1基因扩增产物均有特异性条带,SHG44、D341和正常对照组人脑星形胶质细胞则无;胶质瘤组织中灰度值高于正常组织,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:DKK1在胶质瘤中高表达,且随着肿瘤级别的增高而增高;胶质瘤脑脊液中DKK1含量显著高于神经系统良性肿瘤组及正常对照组,可作为胶质瘤鉴别诊断指标。

Fas/FasL系统在肿瘤细胞耐药中的作用

目的：探讨凋亡基因Ｆａｓ／ＦａｓＬ对肿瘤细胞耐药性的影响。方法：多发性骨髓瘤敏感株ＲＰＭＩ８２２６和耐药株ＲＰＭＩ８２２６／Ｄｏｘ４０分别和Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ、ＣＨ１１作用，在不同时间和浓度下观察二株细胞的Ｆａｓ／ＦａｓＬ的表达和死亡情况。结果：Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ能上调Ｆａｓ／ＦａｓＬ在敏感株肿瘤细胞表面的表达，从而激发ＰＣＤ，而耐药株则无此作用。结论：耐药细胞通过改变其Ｆａｓ／ＦａｓＬ系统的表达拮抗化疗药物引起的ＰＣＤ。