鱼用降肝脂益生菌的筛选及鉴定

为了获得具有预防及缓解鱼类脂肪肝作用的益生菌,以从半滑舌鳎肠道中分离出的13株水产动物肠道菌为实验菌株,通过体外产胆盐水解酶能力检测,获得产胆盐水解酶能力较强的菌株.将13株菌株进行斑马鱼的饲喂与浸浴实验,测定斑马鱼的体质量和肝脏中甘油三酯含量并进行肝脏油红O染色切片观察,对于可高效降解斑马鱼肝脏脂肪的菌株进行分子鉴定和系统发育树构建.结果显示,菌株ND-1和U3的产胆盐水解酶能力最强,其次是菌株SC-03和YA6.菌株ND-1和YA6的胆固醇去除率分别为89.76%和89.69%;菌株M4和U3的胆固醇去除率分别为80.26%和76.39%.菌株YZ-02、U2、SC-04和ND-1可以减轻斑马鱼的体质量,菌株SC-01、YZ-02、U3和SH-1可以降低斑马鱼肝脏中的甘油三酯含量,菌株YZ-01、ND-1和U3可有效缓解斑马鱼肝脏中脂滴的沉积.综合来看,菌株U3和ND-1对斑马鱼肝脏脂肪肝的降脂效果最好,分子鉴定和系统发育树构建结果表明,ND-1可与马胃葡萄球菌(Staphylococcus equorum strain Y15,JX134628)聚为一支,置信度为100%,菌株U3能够与鼠李糖乳酸杆菌(Lacticaseibacillus rhamnosus strain 5681,MT463591)聚为一支,置信度为98%.

复合益生菌发酵培养基与冻干保护剂的筛选

为实现对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、格式乳球菌(Lactococcus garvieae)、施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)和酵母菌(Yeast)4株水产养殖益生菌菌株的共发酵培养,进行了单一无机盐去除实验和冻干保护剂筛选实验.结果显示:①4株益生菌复合发酵培养基的具体成分包括葡萄糖20 g、蛋白胨10 g、牛肉浸粉5 g、酵母粉5 g,硫酸镁0.1 g、柠檬酸氢二铵2 g、磷酸氢二钾2 g、硫酸锰0.05 g、吐温801 mL、蒸馏水1000 mL;②枯草芽孢杆菌只有在去除乙酸钠的培养基中才会生长,去除乙酸钠对其余菌株生长影响不显著;③当柠檬酸氢二铵、硫酸镁、磷酸氢二钾和硫酸锰4种无机盐在共发酵培养基中分别去除时均会对某些菌株的生长造成抑制,所以4种无机盐在共发酵培养基中的添加十分必要;④复合益生菌的最佳吸附剂为玉米粉,最佳冻干保护剂为脱脂奶粉,最佳使用质量分数为16%.

lat基因的失活在提高棒状链霉菌棒酸产量中的应用

利用lat基因突变的重组质粒pKCLHS对紫外诱变的克拉维酸(Clavulanic acid)高产菌株Streptomyces clavuligerusB71-14的lat基因进行了插入失活,对获得的基因突变子进行了PCR验证、菌体生长测定、发酵特征测定,并对发酵液中的克拉维酸进行了初步提取和含量测定.结果表明,突变菌株的lat基因中插入了含有阿泊拉抗性的基因片段,突变菌株的生长速度与原始菌株无明显变化l,at突变菌株的克拉维酸产量最高能达到其原始菌株的1.11～1.29倍,产头霉素C的能力显著降低.

紫外分光光度法测定发酵液中克拉维酸含量的研究

利用克拉维酸与咪唑的衍生物在312nm下具有特征吸收的原理对其含量进行测定犤1犦,回收率为99.1%～101.7%,衍生后的克拉维酸稳定性较好,增加了测量的准确性,并与高效液相色谱法进行了比较,实验表明该方法具有准确、简便、快速、操作系统简单等特点,对于成品及半成品两种方法测定结果一致,是一种用于检测发酵液中克拉维酸含量的简便、快捷的方法。

PCR-Targeting体系构建棒状链霉菌基因突变株

棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)可产生多种β-内酰胺类化合物,其中包括克拉维酸。利用聚合酶链式反应(PCR)-Targeting体系构建棒状链霉菌突变株是获得克拉维酸高产菌株的又一可行方法。采用该体系对棒状链霉菌的lat基因进行了敲除,获得了没有抗性标记的lat基因被敲除的突变株S.clavuligerus lat::scar,其克拉维酸产量是出发菌株的2.8倍。由于最终构建的突变株没有抗性标记,因此可以将该方法应用于突变棒状链霉菌的其他基因,实现用一种抗性标记突变同一菌株不同基因的目的,为链霉菌的基因突变提供了又一种有效的方法。

原生质体融合法提高棒状链霉菌的克拉维酸产量

采用原生质体融合技术,将克拉维酸生产菌——棒状链霉菌甘油耐受性突变株B71-14和舒巴坦钠耐受性突变株B71-50进行了原生质体融合。以2种抗性为选择标记,筛选融合子。从形态上与2亲本菌株不同的98株融合子中发现了1株融合子F-11,既有甘油抗性又有舒巴坦钠的抗性,其克拉维酸产量为742.71 mg/L,是亲本菌株B71-14(538.20 mg/L)的1.38倍,是亲本菌株B71-50(479.91 mg/L)的1.55倍。

PCR-寻靶体系构建棒状链霉菌lat基因插入突变的重组质粒pELA

本实验将PCR所得的1.8kb的lat基因片段插入到pUCm-T载体的多克隆位点,得到重组质粒pUCm-T-lat,经EcoRI-HindⅢ双酶切后得到lat基因片段,与经同样双酶切的穿梭质粒pGH112进行连接,得到重组质粒pGH112-lat。将其电转至大肠杆菌E.coli BW25113/pIJ790中得到E.coli BW25113/pIJ790/pGH112-lat。同时,根据棒状链霉菌lat基因的序列及质粒pIJ77(3 pIJ773为可提供阿泊拉抗性的模板质粒)中阿泊拉抗性基因(aac(3)iv)的序列设计一对长59nt及58nt的引物,两引物分别含有20nt及19nt的阿泊拉抗性基因的互补序列和39nt的lat基因两端的互补序列,以质粒pIJ773为模板,PCR扩增得到的产物为两端带有lat基因上下游同源序列的阿泊拉抗性基因,将此PCR产物称为阿泊拉抗性框,将此阿泊拉抗性框电转至E.coli BW25113/pIJ790/pGH112-lat转化子中。在质粒pIJ790的作用下,阿泊拉抗性框中两端的lat基因同源序列与pGH112-lat中的野生型lat基因发生同源双交换,使得阿泊拉抗性框插入lat基因中,得到lat基因中插入阿泊拉抗性基因(lat::apr)的重组质粒pELA。该质粒的构建为进一步构建棒状链霉菌lat基因插入阻断的突变株,从而实现克拉维酸产量的提高奠定了初步基础。

claR基因的扩增对棒状链霉菌棒酸合成的影响

从棒状链霉菌中克隆对克拉维酸具有正调控作用的基因claR。构建了claR的重组质粒pSET152-claR,通过接合转移将重组质粒pSET152-claR转入了野生型S.clavuligerus中,通过pSET152-claR中的attP位点整个质粒插入到S.clavuligerus基因组中的attB位点,实现了S.clavuligerus基因组DNA中增加一个拷贝claR基因的目的,所得突变株S.clavuligerus∷claR通过发酵培养,HPLC检测克拉维酸产量为原产量的1.86倍。

扩增ccaR基因提高棒状链霉菌克拉维酸产量的研究

在棒状链霉菌B71-14中扩增对克拉维酸具有正调控作用的基因ccaR,构建了ccaR的重组质粒pSET152-ccaR,通过接合转移将重组质粒pSET152-ccaR转入了S.clavuligerus B71-14中,通过pSET152-ccaR中的attP位点整个质粒插入到S.clavuligerus B71-14基因组中的attB位点,实现了S.clavuligerus B71-14基因组DNA中增加一个拷贝ccaR基因的目的,所得突变株S.clavuligerus::ccaR产酸量可达820.91mg/L,较出发菌株提高了54%.

发酵液中克拉维酸含量的测定方法

介绍了3种测定克拉维酸含量的方法,即高效液相色谱法、紫外分光光度法与生物效价法,3种方法测定结果进行分析研究,得出三种方法之间具有较好的相关性。高效液相色谱法及紫外分光光度法均基于克拉维酸与咪唑反应衍生后的衍生物在312nm处有特征吸收,且衍生后的色谱图在反相高效液相色谱柱上可有效避免发酵液中其他组分的干扰;生物效价法采用KlebsiellapneumoniaeATCC29665作为指示菌。由于3种方法测定结果之间具有相关性,可以根据不同的实验条件及实验目的选用不同的检测方法。

产克拉维酸的棒状链霉菌突变株的选育

以棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus),B71为出发菌株,通过紫外线诱变育种,采用琼脂块法初筛和摇瓶发酵复筛,选育出2株甘油耐受性正向突变株S.clavuligerus B71—14和S.clavuligerus B71-49,在摇瓶条件下,其克拉维酸产量与出发菌株S.davuligerus B71相比,分别提高了90.6%和88.8%,并具有良好的遗传稳定性。

棒状链霉菌中lat基因的突变及其对克拉维酸产量的影响

以棒状链霉菌Streptomyces clavuligerus NRRL3585的染色体为模板扩增得到1条1.77kb的lat基因片段,并将其用于构建重组质粒pKCLES。将pKCLES由E.coli ET12567接合转移至S.clavuligerus中。重组质粒pKCLES与S.clavuligerus染色体中野生型lat基因发生同源交换,从而获得了带有阿泊拉抗性的突变菌株。对S.clavuligerus NRRL3585以及lat突变菌株的基因组进行PCR验证,且测定了这2种菌株的产头酶素C的能力。结果均表明,突变菌株中的lat基因中插入了含有阿泊拉抗性的pKC1139片段而遭到了破坏。另外,以HPLC法测定了这2种菌株在不同培养时间(72h和96h)下的克拉维酸的产量,结果显示,lat突变菌株的克拉维酸产量最高能达到其原始菌株的2.3倍。

无机盐MgCl_2和微量金属离子Zn^(2+)对克拉维酸产量的影响

对本实验室UV诱变获得的棒状链霉菌Streptomyces clavuligerus B71-14在优化培养基配方的基础上,考察不同微量金属离子对克拉维酸发酵产量的影响,确定Zn2+对其发酵产量有比较明显的促进作用.进一步考察不同添加浓度MgCl2和Zn2+对克拉维酸合成趋势的影响,确定在本实验发酵培养基中MgCl2和Zn2+的最佳添加量分别为1.5,g/L和00.5,g/L最佳添加浓度,并在最适添加浓度下考察其对发酵代谢过程参数的影响,其最高产量与不添加相比分别提高了457.6%和631.0%.

增加ccaR基因剂量提高棒状链霉菌克拉维酸产量的研究

CcaR蛋白对棒状链霉菌(S.clavuligerus)中克拉维酸的合成具有正调控作用,由ccaR基因编码。PCR获得包含ccaR完整基因及其上下游一定区域的扩增产物,构建重组质粒pSET152-ccaR并转化大肠杆菌ET12567/pUZ8002后,通过属间接合转移至棒状链霉菌B71-14中。pSET152含有attP位点,可以与链霉菌基因组中的attB位点特异性同源整合,将重组质粒pSET152-ccaR携带的ccaR插入到S.clavuligerusB71-14染色体中的attB位点,实现了在S.clavuligerusB71-14基因组中增加一个拷贝ccaR基因的目的,所得的突变株S.clavuligerusB71-14:ccaR产酸量可达821.92 mg/L,是出发菌株的1.54倍。

凡纳滨对虾肠道内产消化酶益生菌的分离与筛选

为获得具有消化酶活性且安全的益生菌,从凡纳滨对虾肠道中初步分离得到576株细菌,对菌株进行产蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶能力的定性及定量测试,筛选出产酶种类多且产酶能力强的菌株11株。对筛选出的11株菌进行了幼虾浸浴实验、药敏性实验和溶血性实验,以评价其生物安全性。将11株菌的菌悬液添加到凡纳滨对虾幼虾的养殖水体中进行浸浴实验,浸浴结束后用鳗弧菌进行刺激,测定不同浸浴组幼虾相关免疫基因的相对表达量,以确定其对幼虾的保护效果。综合消化酶活性、菌株对幼虾的保护效果及生物安全性,筛选得到4株效果较好的菌株。菌株的16S r DNA分子鉴定结果表明,细菌1号、2号和4号分别与芽孢杆菌(Bacillus sp.PCSAS2-38,GQ284495.1)、蜡样芽孢杆菌(B.cereus strain N419,JN400121.1)及苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis strain EA26.1,KC758847.1)的相似性均为100%,9号菌株与荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus strain PSB-03,FJ866782.1)相似性达到99%,为后续益生菌制剂的开发奠定了前期基础。

天津市周边地区养殖凡纳滨对虾肠道菌株的分离鉴定及耐药性分析

随着抗生素在水产养殖业中的普遍应用,细菌耐药性成为环境和食品安全的主要问题。本文旨在通过对天津地区养殖凡纳滨对虾体内细菌的耐药信息进行分析统计,为凡纳滨对虾养殖业的疾病控制和提高水产品安全性提供理论指导。本研究对天津市津南区、汉沽区及西青区等对虾养殖基地取样的凡纳滨对虾进行肠道微生物的分离培养,抗生素药敏实验以及抗生素抗性基因的检测。共获得菌株1 219株,选取其中有代表性的215株菌株进行鉴定,结果显示,所鉴定菌株属于56种不同种属,主要以芽孢杆菌、副溶血性弧菌、葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、席罗弧菌、溶藻弧菌、格氏乳球菌、希瓦氏菌、霍氏肠杆菌、库特氏菌、施氏假单胞菌、荚膜红细菌、液化沙雷氏菌、不动杆菌、假单胞菌、假交替单胞菌及霍乱弧菌等为主。所鉴定菌株的抗生素药敏实验分析结果发现,凡纳滨对虾肠道微生物普遍存在抗生素抗性,其中β-内酰胺类的氨苄西林、糖肽类的杆菌肽、喹诺酮类的罗美沙星和磺胺类的磺胺抗药性最为明显。因此本文进一步对其中耐药种类较多且耐药性较强的82株细菌对四大类抗生素(链霉素类、磺胺类、四环素类和青霉素类)的抗性基因(str A-str B,sul II,sul II,sul III,tet A,tet C,tet G,blao XA-1,bla PSE-1,bla TEM)以及整合子(in T1和in T2)携带情况进行检测。研究结果表明,所检测耐药菌株均携带抗性基因,其中磺胺类抗性基因的检出率最高,可达63%,其次是青霉素类抗性基因,检出率为61.4%,整合子基因平均检出率为42.1%,四环素类相对较少为35.4%,且四环素类只检测出tet A抗性基因,其中67.1%的菌株存在多种耐药基因。

高通量测序法分析两株益生菌对凡纳滨对虾肠道菌群结构的影响

为分析荚膜红细菌和蜡样芽孢杆菌2株益生菌对凡纳滨对虾肠道菌群结构的影响,本实验对凡纳滨对虾进行为期30 d的养殖饲喂实验,饲喂后期利用高通量测序凡纳滨对虾肠道微生物的16S rDNA V4区,来分析不同益生菌饲喂后凡纳滨对虾肠道菌群的结构特征,并结合对虾体质量增加率和攻毒后累计死亡率的宏观指标来进行分析。结果显示:(1)空白组(CK)、荚膜红细菌组(Rc)和蜡样芽孢杆菌组(Bc)样品OTU范围为374～506,其中CK组对虾肠道菌群OTU数量最低,饲喂益生菌后的2组对虾肠道菌群中OTU数量相对较高;(2)在门分类水平上,3组的变形菌门数均为最多,CK组主要为变形菌门和少量拟杆菌门,Bc组主要有变形菌门、拟杆菌门、无壁细菌门、厚壁细菌门和假单胞菌,Rc组主要是变形菌门、拟杆菌门、厚壁菌门、酸杆菌门、放线细菌、梭杆菌门和蓝细菌;(3)稀释曲线和Shannon指数结果可见,CK组样品物种丰度和复杂度最低,且Bc组样品丰度和复杂度相对较高;(4)PCA分析发现,Rc组和CK组样品微生物组成较为接近,结合宏观对虾体质量增加率和攻毒后累计死亡率的结果分析,可见相较于荚膜红细菌,蜡样芽孢杆菌对凡纳滨对虾肠道微生物菌群影响更显著,且益生效果更佳。研究表明,饲喂益生菌可以扩增对虾肠道微生物菌群丰度,并能抑制弧菌属等有害菌群的生长,提高对虾体质量增加率并降低死亡率,从而达到益生效果,其中以饲喂蜡样芽孢杆菌菌株效果更佳。

Biolog-ECO方法探究饲喂益生菌对凡纳滨对虾肠道微生物代谢及有效作用时间的影响

以霍氏肠杆菌(E3)和乳酸菌(R3)2株益生菌对凡纳滨对虾进行为期4周的养殖饲喂实验,饲喂后期利用Biolog-ECO方法对实验组及空白组的凡纳滨对虾肠道微生物菌群多样性的差异进行比较分析,以评价益生菌对凡纳滨对虾肠道微生物菌群代谢功能的影响。结果显示,添加霍氏肠杆菌(E3)或乳酸菌(R3)的实验组,与空白组相比较,平均每孔颜色变化率显著上升,表明益生菌增强了肠道微生物活性;凡纳滨对虾肠道微生物利用各类碳源的整体能力显著增强,表明益生菌可以促进水产动物的代谢功能;肠道微生物多样性指数(包括Shannon、Simpson和McIntosh指数)有明显差异,表明饲喂2株益生菌可以提高凡纳滨对虾肠道菌群的丰富度。其中,停喂霍氏肠杆菌后第1天和第5天取样结果表明,Shannon指数显著降低,Simpson和McIntosh指数显著升高;停喂乳酸菌后的第1天和第5天取样结果表明,Shannon指数无显著差异,Simpson和McIntosh指数显著升高;二者在第10天取样的结果中均无显著差异,表明饲料中添加益生菌可以改变凡纳滨对虾肠道内原有菌群的数量和结构,促进对虾肠道内微生物群落间复杂的相互作用,进而在维持或者促进对虾健康方面发挥着重要的作用,同时也表明此两株益生菌在凡纳滨对虾肠道中停留时间最少为5 d。

凡纳滨对虾肠道益生菌的分离·筛选·鉴定

[目的]获得具有拮抗常见病原菌活性、消化酶活性且具有安全性的凡纳滨对虾肠道内源性益生菌。[方法]从健康凡纳滨对虾肠道中经过初步分离与纯化得到1 220株细菌,对分离的菌株进行拮抗试验,并对产蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶能力进行定量和定性研究。对筛选的13株细菌进行了溶血试验和药敏试验,以评价其生物安全性。[结果]共筛选出13株抑菌活性强、产酶能力强且产酶种类多的菌株,最终确定了2株候选益生菌。菌株的16 S rDNA分子鉴定及Biolog系统鉴定结果表明,细菌3号与霍氏肠杆菌(Enterobacter hormaechei strain WW2,JN993998.1)相似性达到98%,细菌6号与乳酸菌(Lactic acid bacterium ZJGS0109,KC748440.1)相似性达100%。[结论]研究结果为今后益生菌制剂的开发和应用奠定了基础。

酪蛋白生物活性肽的生理作用及其研究进展

酪蛋白经酶水解可得到具有不同结构的肽类,其的许多肽具有不同的生理功能,被称为"生物活性肽".酪蛋白生物活性肽可以被看作是人体潜在的调节器.阿片肽类是类鸦片活性受体的配体,具有激活或拮抗的活性.阿片拮抗肽具有抗阿片活性的作用.酪蛋白免疫活性肽能够刺激机体淋巴细胞的增殖、增强巨噬细胞的吞噬能力.抗高血压肽具有抗高血压的活性.抗血栓肽抑制血纤蛋白源与血小板上的特异受点结合,并抑制血小板凝集.矿质元素结合肽能与矿物质形成可溶性盐类,并可作为多种矿物质尤其是钙的载体.抗菌肽具有杀灭敏感微生物的活性.具有抗诱变活性的肽既有使致突变剂灭活的细胞外作用又有保护细胞免受损伤的抗突变效应.此外还有一些具有其他生物活性的酪蛋白肽类,如酪蛋白糖肽和促进DNA合成的肽等.生物活性肽作为外援调节物的物化作用机制目前还并不十分清楚,但酪蛋白来源的生物活性肽已显示出其特有的功能活性,其中有些已被当作食品添加剂用于功能性食品,护齿保健品或药品.