他克莫司对肝移植急性排斥反应大鼠肠道菌群的影响

目的探讨他克莫司对心脏死亡器官捐献(donation after cardiac death,DCD)供肝移植后急性排斥反应大鼠肠道菌群的影响。方法构建稳定运行的常温机械灌注(normothermic machine perfusion,NMP)系统。夹闭Lewis大鼠胸主动脉30 min获取DCD肝脏,以棕色挪威大鼠(BN)为受体,建立原位肝移植急性排斥反应模型。根据对肝脏的不同处理方法,将BN大鼠分为以下3组:假手术(Sham)组、单纯NMP(NMP)组及NMP联合术后他克莫司(FMP)组,每组6只,术后14 d收集血液、肝脏和肠道内容物样本。血液标本检测肝功能,HE染色观察肝脏组织学变化并计算排斥活动指数(rejection activity index,RAI),16 SrDNA检测肠道内容物,观察各组肠道菌群结构、多样性及功能变化。结果FMP组(中位生存期>60 d)大鼠存活时间较NMP组(中位生存期为16.5 d)延长,肝功能和肝组织病理较NMP组显著改善(P<0.05)。计算RAI结果显示,FMP组(2.00±1.23)显著低于NMP组(7.60±1.14)(P<0.05)。与NMP组相比,FMP组肠道菌群丰度下降,两组在物种之间有明显差异,FMP组富含厚壁菌门、阿克曼菌科和毛螺菌科,且富集其他聚糖降解和鞘脂代谢通路。结论他克莫司能够改善DCD供肝移植后急性排斥反应大鼠肝损伤,同时调节肠道菌群结构和代谢途径。

树突状细胞疫苗联合Imiquimod对小鼠乳腺肿瘤的治疗作用

目的观察局部应用TLR7激动剂Imiquimod对树突状细胞(dendritic cell,DC)疫苗治疗小鼠肿瘤的影响,寻找增强DC肿瘤疫苗疗效的佐剂。方法培养乳腺肿瘤细胞株EMT-6,反复冻融法制备肿瘤相关抗原,小鼠乳腺区注射EMT-6制备荷瘤动物模型。用含重组小鼠GM-CSF和IL-4的培养液扩增培养Balb/c小鼠来源的BM-DC,负载肿瘤相关抗原(Ag-DC)后进行肿瘤治疗实验。荷瘤小鼠分别采用Imiquimod局部涂抹、Ag-DC皮内注射、Imiquimod联合Ag-DC进行治疗,检测不同处理方法小鼠的肿瘤生长情况。采用上述方案免疫Balb/c小鼠后细胞增殖抑制实验检测小鼠脾脏淋巴细胞对EMT-6细胞的杀伤效应。流式细胞术检测Imiquimod处理局部皮肤对BM-DC向局部引流淋巴结(DLN)迁移的影响。结果 Imiquimod联合Ag-DC治疗荷瘤小鼠可明显抑制肿瘤生长,与单纯Imiquimod、Ag-DC治疗组及NS处理对照组比较差异具有显著性。Imiquimod联合Ag-DC免疫小鼠后脾脏淋巴细胞杀伤肿瘤细胞能力较其它组明显增强。局部涂抹Imiquimod后注射BM-DC,24 h后DLN内BM-DC数量较对照组明显增多。结论 TLR7激动剂Imiquimod可增强BM-DC疫苗诱导的免疫应答,提高肿瘤治疗效果。其机制可能与Imiquimod诱导DLN BM-DC细胞数量增多有关。

熊果酸通过调控PTGS2对小鼠肝缺血/再灌注损伤的保护作用

目的探索植物提取物熊果酸(ursolic acid,UA)减轻肝缺血/再灌注损伤(hepatic ischemia reperfusion injury,HIRI)的作用及初步作用机制。方法C57雄性小鼠分为假手术组、假手术组+UA组、HIRI组、HIRI低剂量组和HIRI高剂量组。通过动物实验、网络药理学和分子生物学等方法进行分析验证。结果动物实验显示UA显著降低HIRI小鼠血清中AST、ALT的活性。利用TCMSP、Pharm Mapper、Swiss Target Prediction、GeneCards等数据库获取熊果酸与HIRI对应的靶基因,再利用DAVID、STRING以及Cytoscape得到初步关键靶基因,它们是PPARG(peroxisome proliferator-activated receptor gamma,PPARG)、MAPK3(mitogen-activated protein kinase 3,MAPK3)及PTGS2(prostaglandin G/H synthase 2,PTGS2)。最后,根据分子对接得分、受体与配体结合的氢键数目,确定PTGS2为本研究的hub靶基因。后经免疫组化实验验证,与假手术组比较,PTGS2在HIRI组中高表达(P<0.01);与HIRI组比较,PTGS2在HIRI低剂量组及HIRI高剂量组的表达明显降低(P<0.01)。结论熊果酸通过调控PTGS2对小鼠肝缺血/再灌注损伤的保护作用,该研究为临床研制干预HIRI的新药提供了参考。

肝硬化食管静脉曲张患者门静脉血栓形成的危险因素分析

目的旨在识别肝硬化食管静脉曲张患者中门静脉血栓(PVT)形成的独立危险因素,并建立一个预测PVT发生风险的列线图。方法回顾性分析2013年12月—2018年12月于山东大学附属省立医院就诊的283例肝硬化食管静脉曲张患者资料,根据影像学检查将其分为PVT组(n=119)和非PVT组(n=164)。计量资料两组间比较采用t检验或Mann-Whitney U检验,计数资料两组间比较采用χ2检验。利用多因素logistic回归分析筛选独立危险因素,基于多因素回归结果建立并检验列线图,应用C指数(C-index)、校准曲线评价其性能。结果单因素分析显示,PVT组在Child-Pugh分级(χ^2=9.388,P=0.009)、脾切除史(χ^2=26.805,P<0.001)、WBC(Z=-2.248,P=0.025)、PLT(Z=-3.323,P=0.001)、D-二聚体水平(Z=-6.236,P<0.001)及脾脏厚度(Z=-2.432,P=0.015)方面高于非PVT组,而TG水平低于非PVT组(Z=-4.150,P<0.001)。多因素分析显示,TG水平(OR=0.441,95%CI:0.190~0.889)、D-二聚体水平升高(OR=1.151,95%CI:1.041~1.272)、PT延长(OR=1.160,95%CI:1.025~1.313)、有脾切除史(OR=2.933,95%CI:l.164~7.389)是肝硬化食管静脉曲张患者PVT形成的独立风险因素。基于多因素回归结果,建立了列线图,其C指数值为0.745,校准曲线显示PVT发生的观测值和预测值之间有较好的一致性。结论TG水平降低、有脾切除史、D-二聚体水平升高、PT延长是肝硬化食管静脉曲张患者PVT形成的独立危险因素,基于此所建立的列线图,为临床医生评估PVT形成风险提供了一个定量、直观的工具。

骨髓间充质干细胞来源外泌体通过铁蛋白自噬抑制肝星状细胞活化的研究

目的探讨骨髓间充质干细胞来源的外泌体(BMMSC-exos)对活化肝星状细胞(HSC)的作用及其机制。方法应用脂多糖(LPS)诱导HSC形成激活体外模型。按照实验要求分为对照组(Con)、活化组(LPS)、LPS+BMMSCs(L+B)组、LPS+BMMSC-exo(L+B-exo)组、L+B-exo+小干扰RNA阴性对照组(si-NC)及L+B-exo+敲降NCOA4组(si-NCOA4)。通过细胞增殖测定细胞活力;实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测平滑肌激动蛋白(α-SMA)、核受体共激活因子4(NCOA4)和铁蛋白(FTH1)mRNA;蛋白质免疫印迹法检测NCOA4、FTH1、波形蛋白(Vimentin)、α-SMA、谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)、p62、环氧合酶-2(COX-2)、苄氯素1(Beclin 1)及微管相关蛋白(LC3)蛋白表达水平;免疫荧光化学检测NCOA4、FTH1及Vimentin表达;检测丙二醛(MDA)、还原型谷胱甘肽(GSH)及脂质活性氧(Lipid ROS)含量变化,多组间的数据比较采用单因素方差分析。结果BMMSC-exos对活化的HSC-T6细胞的影响:L+B-exo组纤维化标志物α-SMA和Vimentin表达量(0.58±0.04、0.25±0.05)低于LPS组(1.26±0.04、1.06±0.03)和L+B组(0.76±0.04、0.75±0.15,F=50.607、35.916,P<0.05)。BMMSC-exos促进活化的HSC-T6细胞铁死亡和自噬:L+B-exo组MDA与Lipid ROS的表达量[(4.27±1.06)nmol/(mg·prot)、8950.49±114.34]高于LPS组[(2.27±0.73)nmol/(mg·prot)、5492.73±25.69]和L+B组[(3.27±0.90)nmol/(mg·prot)、7198.05±116.63,F=1.263、1372.009,P<0.05];L+B-exo组GSH水平[(10.47±0.31)μg/10^(6)cells]低于LPS组[(15.94±0.11)μg/10^(6)cells]和L+B组[(12.60±0.15)μg/10^(6)cells,F=646.842,P<0.05];L+B-exo组NCOA4蛋白表达量[(1.19±0.06)]高于LPS组[(0.73±0.12)]和L+B组[(0.95±0.13),F=44.456,P<0.05];L+B-exo组FTH1蛋白表达量(0.25±0.05)低于LPS组(1.06±0.03)和L+B组(0.75±0.15,F=35.916,P<0.05)。NCOA4介导的铁蛋白自噬参与BMMSC-exos对HSC-T6细胞的作用:si-NCOA4组的MDA[(0.83±0.11)nmol/(mg·prot)]低于si-NC组[(1.17±0.09)nmol/(mg·prot),F=17.217,P<0.05]。结论BMMSC-exos通过NCOA4介导的铁蛋白自噬诱导活化的HSC铁死亡,从而抑制HSC活化,发挥抗肝纤维化作用。

铁死亡在骨髓间充质干细胞调控肝纤维化中的作用

目的探讨铁死亡在骨髓间充质干细胞(BMMSCs)调控肝星状细胞(HSCs)活化和肝纤维化中的作用。方法选取5只SD雄性大鼠(北京军事医学科学院动物实验中心提供)腹腔注射橄榄油12周作为对照组;选取15只SD大鼠腹腔注射含40%CCl4的橄榄油8周建立大鼠肝纤维化模型,采用随机数表法分为模型组、BMMSCs治疗组和小檗碱组,每组5只;将大鼠肝星状细胞(HSC-T6)分为对照组(Ctrl)、血小板衍生因子(PDGF-BB)激活组、PDGF-BB+BMMSCs共培养组、PDGF-BB+爱拉斯汀(erastin)组及PDGF-BB+BMMSCs+铁死亡抑制剂(fer-1)组。通过苏木精-伊红和天狼猩红染色评估肝脏病理,检测不同组别的丙二醛(MDA)和还原型谷胱甘肽(GSH)含量,通过蛋白质印迹法(Western blot)和免疫荧光检测细胞纤维化和铁死亡指标水平。两组间数据比较采用独立样本t检验;3组及以上数据比较采用单因素方差分析。结果BMMSCs组肝细胞变性、坏死及胶原纤维沉积明显减轻;BMMSCs共培养组α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达水平低于PDGF-BB激活组(0.80±0.10比1.13±0.06,F=32.914,P<0.05)。BMMSCs组大鼠肝脏MDA含量高于模型组[(0.37±0.02)μmol/mg比(0.23±0.02)μmol/mg,F=56.360,P<0.05]。BMMSCs共培养组MDA含量高于PDGF-BB激活组[(1.54±0.18)nmol/mg prot比(1.14±0.06)nmol/mg prot,F=16.397,P<0.05],GSH含量低于PDGF-BB激活组[(0.63±0.05)μg/10^(6) cells比(0.96±0.03)μg/10^(6) cells,F=50.638,P<0.05]。fer-1预处理组细胞活力高于BMMSCs共培养组[(78.50±2.73)%比(24.07±8.92)%,F=89.533,P<0.05],并且fer-1抑制BMMSCs介导的诱导细胞发生铁死亡和减轻纤维化作用。结论铁死亡参与BMMSCs抑制HSCs活化和减轻肝纤维化过程。

调控活化的肝巨噬细胞在肝缺血再灌注损伤中的应用

肝缺血再灌注损伤是影响肝移植和其他肝脏手术患者预后的重要因素,目前仍缺乏有效的防治方法。活化后的巨噬细胞在抗炎和促炎表型间的动态转化是影响病程进展的重要因素。因此,调控肝巨噬细胞功能表型的转化是减轻肝缺血再灌注损伤潜在的治疗策略之一。本文综述了巨噬细胞在肝缺血再灌注中的作用及近年来靶向肝巨噬细胞的治疗方法,并概述其在肝缺血再灌注损伤中发挥的作用及治疗价值。

铁死亡在大鼠骨髓间充质干细胞减轻肝硬化中的作用

目的研究铁死亡是否参与大鼠骨髓间充质干细胞(BMMSCs)减轻肝硬化的过程。方法2021年6月至12月,选取10只SD大鼠(军事医学科学院动物实验中心提供)腹腔注射橄榄油12周作为对照组,另30只SD大鼠腹腔注射含40%四氯化碳(CCl4)的橄榄油混合液8周建立大鼠肝硬化模型,采用随机数表法分为模型组、BMMSCs组及小檗碱组(n=10),分别注射磷酸缓冲盐溶液(PBS)、BMMSCs及小檗碱灌胃处理4周,干预结束后检测肝脏功能,苏木精-伊红(HE)及天狼星红染色检测肝脏病理,实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测肝脏组织Ⅳ型胶原蛋白基因α1(COL4a1)、透明质酸酶1(Hyal1)mRNA,RT-qPCR、蛋白质免疫印迹法(Western blot)及免疫组织化学检测长链脂酰辅酶A合成酶4(ACSL4)、铁蛋白重链1(FTH1)、谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)的mRNA及蛋白表达,检测丙二醛(MDA)、还原型谷胱甘肽(GSH)及Fe^(2+)含量变化,两组间比较采用t检验。结果采用符合标准的BMMSCs,并成功建立大鼠肝硬化模型。BMMSCs组Ishak评分及分期均低于模型组[评分:(4.00±1.00)比(11.33±2.08)分、分期:(2.33±0.58)比(5.67±0.58),t=-5.500、-7.071,P<0.05],肝功能较模型组显著改善[ALT:(44.07±0.60)U/L比(897.47±14.25)U/L、AST:(65.83±1.39)U/L比(2158.73±36.85)U/L、ALB:(39.13±1.29)g/L比(29.47±1.62)g/L,t=-103.610、-98.309、8.096,P<0.05]。铁死亡相关结果显示,BMMSCs组较模型组ACSL4、FTH1蛋白表达均升高[ACSL4:(1.17±0.14)比(0.49±0.12)、FTH1:(0.94±0.07)比(0.38±0.07),t=6.458、9.667,P<0.05],但GPX4蛋白表达升高[(0.75±0.06)比(0.41±0.09),t=5.253,P<0.05],mRNA水平与蛋白表达呈现一致;BMMSCs组较模型组MDA及Fe^(2+)的生成均增加[MDA:(0.41±0.03)μmol/mg比(0.21±0.03)μmol/mg、Fe^(2+):(5.84±0.26)nmol/mg比(2.64±0.14)nmol/mg,t=8.464、18.700,P<0.05],GSH的生成减少[(102.08±1.30)μg/ml比(220.11±1.68)μg/ml,t=-96.163,P<0.05],差异均有统计学意义,铁死亡指标表达上小檗碱组与BMMSCs组相似。结论铁死亡参与了BMMSCs改善大鼠肝硬化过程,其机制可能与BMMSCs破坏过氧化与抗过氧化平衡相关。

优化的骨髓间充质干细胞减轻受损脂肪变肝细胞的机制

目的探讨血红素加氧酶1(HO-1)修饰的骨髓间充质干细胞(BMMSCs)对缺氧/复氧(H/R)诱导的脂肪变肝细胞损伤的作用及其机制。方法将脂肪变大鼠肝细胞(IAR20)按照实验要求分为对照组(Ctrl)、H/R组、H/R+铁死亡抑制剂组(Fer-1)、铁死亡诱导剂组(Erastin)、H/R+BMMSCs(B)组、H/R+HO-1/BMMSCs(HB)组、H/R+HB+小干扰RNA阴性对照组(si-NC)、H/R+HB+敲降GPX4组(si-GPX4)。通过检测不同组别细胞的脂质活性氧(Lipid ROS)、谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)的表达评价铁死亡的严重程度。两组和多组间的数据比较分别采用独立样本t检验和单因素方差分析。结果Fer-1及H/R+B处理组Lipid ROS与MDA的表达量均低于H/R组[(1.65±0.02)、(1.85±0.04)比(3.50±0.03),t=87.600、60.030,P<0.05;(154.50±0.84)%、(228.90±21.49)%比(676.50±22.36)%,t=36.380、25.000,P<0.05];Fer-1及H/R+B处理组GSH水平均高于H/R组[(0.75±0.03)、(0.72±0.04)比(0.45±0.01),t=19.400、17.060,P<0.05];H/R+HB组的Lipid ROS及MDA水平低于H/R+B组[(1.31±0.03)比(1.85±0.04),t=19.400,P<0.05;(150.10±32.82)%比(228.90±21.49)%,t=3.478,P<0.05],其GSH水平高于H/R+B组[(0.81±0.03)比(0.72±0.04),t=4.981,P<0.05]。si-GPX4组的Lipid ROS与MDA表达量均高于si-NC组[(2.87±0.13)比(1.36±0.06),t=18.100,P<0.05;(323.30±12.58)%比(184.30±7.09)%,t=16.670,P<0.05];si-GPX4组的GPX4与GSH表达量均低于si-NC组[(0.45±0.03)比(0.92±0.04),t=7.692,P<0.05;(0.54±0.07)比(0.75±0.15),t=5.076,P<0.05]。结论HO-1/BMMSCs通过促进GPX4的表达抑制铁死亡以修复受损的脂肪变肝细胞。