光生物治疗降低神经黏蛋白表达促进小鼠脊髓损伤修复的实验研究

目的 明确光生物调节(photobiomodulation,PBM)对脊髓损伤后小鼠抑制性瘢痕成分神经黏蛋白表达的影响,及其对神经再生和功能修复的改善作用,阐明PBM下调神经黏蛋白表达的机制。方法 利用皮下埋置360°近红外激光照射光纤,定期连接激光发生装置照射脊髓损伤小鼠,建立脊髓损伤激光治疗模型。将C57BL/6小鼠按照不同处理方式分为三组:Sham组(假手术)、SCI组(脊髓损伤)和SCI+PBM组。采用荧光共染的方法观察不同处理组冰冻切片组织中神经黏蛋白的表达和轴突再生的关系,并明确脊髓损伤后星形胶质细胞是表达神经黏蛋白的责任细胞。采用Western blot和免疫荧光染色检测脊髓组织和原代星形胶质细胞中神经黏蛋白的表达水平。采用实时荧光定量聚合酶链式反应(Reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)、免疫荧光和Western blot的方法检测PBM治疗后星形胶质细胞245 KD神经黏蛋白分子和130 KD神经黏蛋白分子的表达水平。利用葫芦素Ⅰ抑制原代星形胶质细胞中的Janus激酶2-信号转导和转录活化因子3(Janus Kinase 2-Signal Transducer and Activator of Transcription 3,JAK2-STAT3)通路,反向验证PBM干预神经黏蛋白表达的通路。采用Basso Mouse Scale(BMS)评分和足印记实验观察研究中小鼠的运动功能恢复情况。结果 皮下埋置360°近红外激光光纤后,经过7天光照射治疗改善了脊髓损伤小鼠运动功能(P<0.05),足印记实验证实PBM显著提高了脊髓损伤小鼠的步长(P<0.001);在损伤旁区的脊髓组织中,神经黏蛋白的表达被上调(P<0.001),且与星形胶质细胞标志物共标;PBM降低了损伤后7天和14天245 KD神经黏蛋白(P <0.05,P <0.001)和130 KD神经黏蛋白(P<0.01,P<0.01)的表达,伴随轴突再生的增加。分子细胞学实验表明,PBM干预显著降低了脊髓损伤后神经黏蛋白的表达水平(245 KD:P<0.001;130 KD:P<0.001),葫芦素Ⅰ的使用抑制了JAK2和STAT3分子的磷酸化水平(P <0.01,P <0.0001),同时显著降低了星形胶质细胞神经黏蛋白的表达(245 KD:P<0.001;130 KD:P<0.001)。结论 PBM可能通过调节JAK2/STAT3分子轴抑制组织中星形胶质细胞神经黏蛋白的表达,促进小鼠脊髓损伤后轴突再生和运动功能的恢复。

余甘子褐变过程中没食子酸等四种成分含量变化及分析

目的:测定并分析在相对恒温密闭贮藏条件下新鲜余甘子褐变过程中没食子酸、单宁酸、五没食子酰基葡萄糖(β-PGG)、β-胡萝卜素的含量变化。方法:将余甘子果实20℃条件下用棕色广口瓶密封避光储藏,每3天用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)测定没食子酸、单宁酸、β-PGG、β-胡萝卜素的含量及pH值和可滴定酸的变化。结果:余甘子中的没食子酸在自采摘后第19天左右含量最高,余甘子中的单宁酸、β-PGG、β-胡萝卜素在刚采摘第1天含量最高,pH值在第22天最高,而可滴定酸在第4天最高。结论:实验提示褐变过程中可滴定酸比pH值相对灵敏且与没食子酸、单宁酸、β-PGG、胡萝卜素呈相关性趋势,提示没食子酸和可滴定酸可作为褐变过程中质控指标之一,可以为余甘子果实储藏、预防褐变提供一定的参考。

余甘子中没食子酸抑制高糖诱导胰岛β细胞凋亡

目的探究余甘子中没食子酸对高糖诱导胰岛β细胞凋亡的保护作用,为从中药中发现治疗糖尿病的天然化合物提供一定参考依据.方法体内实验造模:以wistar雄性大鼠作为体内研究对象,腹腔注射50mg/kg STZ,造模成功后口服给予25 mg/kg的没食子酸,阳性药选用西格列汀,给药4周后,取血、摘取胰腺,进行HE染色,采用Western blot法测定高糖状态下胰腺组织中NLRP3、TXNIP蛋白表达;体外实验造模:以胰岛瘤细胞株INS-1细胞作为体外研究对象,建立高糖诱导细胞凋亡模型,在无糖RPMI1640完全培养基中添加25mmol/L葡萄糖培养INS-1细胞,以没食子酸为受试样品,将实验分为正常对照、高糖模型、没食子酸低、中、高剂量组.采用MTT法测定细胞活性,采用QPCR法、Western blot法测定高糖状态下INS-1细胞中NLRP3、TXNIP的m RNA表达,检测NLRP3、TXNIP蛋白表达.结果 (1)INS-1细胞在葡萄糖浓度为25 mmol/L的培养基中培养48 h后,与对照组比较,凋亡率升高(P<0.01),表明高糖状态下细胞凋亡模型建立成功.(2)10、5、2.5μmol/L的GA分别处理对照组和高糖模型组细胞,对照组细胞存活率没有明显变化(P>0.05).体内实验中与对照组比,高糖模型组中INS-1细胞中NLRP3、TXNIP的蛋白表达具有统计学差异(P<0.05);GA处理后蛋白表达水平明显下调,有统计学差异(P<0.05),体外实验中与对照组比,高糖模型组中INS-1细胞中NLRP3的蛋白表达有统计学差异(P<0.01),GA处理后蛋白表达水平明显下调(P<0.01);TXNIP的蛋白表达水平上调(P<0.05);GA处理后蛋白表达水平明显下调(P<0.05);(3)与对照组比,高糖模型组中INS-1细胞中NLRP3、TXNIP m RNA表达水平均上调(P<0.01);GA处理后蛋白表达水平明显下调(P<0.01).结论将细胞置于添加25 mmol/L浓度葡萄糖的无糖RPMI1640完全培养基中培养48 h.GA对正常INS-1细胞增殖无影响,GA具有保护高糖状态下INS-1细胞凋亡的作用,其机制可能与GA下调NLRP3、TXNIP的基因表达有关.

测定不同pH条件下三果汤中鞣云实素GA、EGCG、EGC、ECG的含量变化

目的研究及分析三果汤散中没食子酸、鞣云实素、EGCG、EGC、ECG在不同p H磷酸盐缓冲溶液中的含量变化。方法将等量三果汤散分别用不同p H缓冲溶液(p H分别为2、3、4、5、6、7、8)处理,应用RP-HPLC法测定三果汤中没食子酸、鞣云实素、EGCG、EGC、ECG的含量变化。结果 p H值为3时,没食子酸的含量最高;鞣云实素的含量在p H等于3时最高;p H等于2时,EGCG的含量最高;p H等于8时,ECG含量最高;EGC的含量在p H等于2时最高。结论反映了酸碱度对三果汤中的没食子酸、鞣云实素、EGCG、EGC、ECG的含量的影响,可以为三果汤质量控制方面提供更多指标,为三果汤的进一步研究提供一定依据。

不同pH条件下测定藏药三果汤中没食子酸、单宁酸、β-PGG含量变化及分析

目的:研究分析不同pH条件下测定三果汤中没食子酸、单宁酸、β-PGG的含量变化。方法:将三果汤分别加入pH为2、3、4、5、6、7的磷酸缓冲液中,超声提取,用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)测定藏药三果汤中没食子酸、单宁酸、β-PGG的含量。结果:当pH等于3时,三果汤中没食子酸、单宁酸含量最高;单宁酸含量呈先下降后上升的趋势;pH等于5时,三果汤中β-PGG含量最高。结论:本实验提示三果汤中没食子酸、单宁酸、β-PGG分别在pH等于3和pH等于5时含量最高,反映了酸碱度对三果汤中没食子酸、单宁酸、β-PGG含量的影响。测定结果可为藏药三果汤中成分的研究及质量控制等提供一定依据。

RP-HPLC法测定不同pH条件下藏药余甘子干果中柯里拉京、没食子酸、绿原酸、咖啡酸的含量变化

目的：测定并分析在不同p H条件余甘子干果中柯里拉京、没食子酸、绿原酸、咖啡酸的含量变化。方法：将余甘子干果打磨成粉末加入50%的甲醇静置90min提取后分别置于p H 2,3,4,5,6,7的磷酸盐缓冲液中,用反相高效液相色谱测定柯里拉京、没食子酸、绿原酸、咖啡酸的含量变化。结果：余甘子干果中的柯里拉京在p H5时含量最高;没食子酸在p H7时含量最高;绿原酸在p H2时含量最多;咖啡酸在p H6~7时含量最高。结论：可能是因为余甘子在不同酸碱条件下致柯里拉京可分解成没食子酸,绿原酸可分解成咖啡酸。本实验可为余甘子的贮存、药物制备、质量控制及资源开发利用提供一定的参考。

RP-HPLC法测定不同煎煮时间下藏药三果汤中槲皮素鞣花酸柯里拉京的含量变化

目的测定并分析在不同煎煮时间条件下藏药三果汤中槲皮素、鞣花酸、柯里拉京的含量变化。方法分别称取10 g配置好的藏药三果汤散于4个烧杯中,各加入纯净水30 m L,料液比为1:3。将烧杯置于垫有石棉网的电磁炉上,用180℃将其煮沸,待药品沸腾后,将4个烧杯转移到温度为80℃的恒温水浴锅中,进行10、20、30、40 min的煎煮。待煎煮时间均完毕后,静置冷却至室温,过滤,微孔滤膜抽滤,用反相高效液相色谱测定槲皮素、鞣花酸、柯里拉京的含量变化。结果藏药三果汤中的槲皮素、鞣花酸、柯里拉京均在煎煮时间为40 min时含量最高。结论日常中药的煎煮一般均煎煮超过30 min,因此本实验以煎煮时间对藏药三果汤的某些有效成分含量的影响做出研究,为藏药三果汤的最佳煎煮时间以及某些有效成分的提取、制备及资源开发利用提供一定的参考。

熊果酸诱导甲状腺乳头状癌细胞TPC-1凋亡的实验

目的研究熊果酸(ursolic acid UA)在体外对人甲状腺乳头状癌细胞株TPC-1增殖的抑制作用.方法采用不同浓度的UA干预细胞(对照组0μM,实验组3μM、6μM、12μM);MTT法观察同一时间不同浓度的UA和不同时间同一浓度的UA对TPC-1细胞生长情况的影响;流式细胞术(FCM)检测应用UA后TPC-1细胞凋亡情况及细胞周期分布情况;QRT-PCR检测UA干预后TPC-1细胞中Bcl-2、Bax、Caspase-9 m RNA的表达情况;Western blot检测UA干预后TPC-1细胞中Bcl-2、Bax、Caspase-9蛋白的表达情况.结果 MTT实验结果显示UA对TPC-1细胞增殖的抑制呈现出浓度和时间的依赖性,24 h、48 h、72 h的IC50分别为14.21μM、10.56μM、10.39μM;流式Annexin V-FITC/PI双染检测显示UA呈浓度依赖性诱导TPC-1细胞凋亡,且将TPC-1细胞的生长阻滞在S期;QRT-PCR实验发现,对照组与实验组均有Bcl-2、Bax、Caspase-9 m RNA的表达,UA呈浓度依赖性下调Bcl-2 m RNA的表达,上调Bax和Caspase-9 m RNA的表达;Western blot结果显示,对照组与实验组均有Bcl-2、Bax、Caspase-9蛋白的表达,UA呈浓度依赖性下调Bcl-2的表达,上调Bax和Caspase-9的表达.结论熊果酸可显著抑制人甲状腺乳头状癌TPC-1细胞的增殖并诱导其凋亡,为甲状腺癌治疗提供一定思路.

不同pH条件下五倍子中EGCG,EGC,ECG含量测定及分析

目的测定不同pH条件下的五倍子中EGCG（表没食子儿茶素没食子酸酯）、EGC（表没食子儿茶素）、ECG（表儿茶素没食子酸酯）的含量变化。方法应用反向高效液相色谱法，测定在超声1h条件下五倍子中EGCG，EGC，ECG在不同pH的磷酸缓冲液（pH值分别为2、3、4、5、6、7、8）中的含量变化情况。结果EGCG在缓冲液pH值为2—5和6～8区间呈上升趋势，pH值为5—6区间呈下降趋势，且在pH值为8时含量最高；EGC在缓冲液pH值为2～4和7～8区间呈下降趋势，pH值为4—7区间呈上升趋势，且在pH为2时含量最高；ECG在缓冲液pH值为2—3和4—5区间呈下降趋势，pH值为3～4和5—8区间呈上升趋势，且在pH值为8时含量最高。结论五倍子中EGCG，EGC，ECG在不同pH值条件下的含量有变化，反映了酸碱度对五倍子中EGCG，EGC，ECG含量变化的影响，本实验研究可为五倍子的理化性质研究以及质控标准等方面提供一定的参考。

RP-HPLC检测不同pH条件下毛诃子中单宁酸等4种多酚化合物含量变化

目的应用RP-HPLC法分析在不同的pH溶液中,毛诃子中Tannins、GA、β-PGG及Corilagin的含量变化。方法将毛诃子粉末分别采取回流提取方法的产物加入pH为2-7缓冲液,用反相高效液相色谱测定单宁酸、没食子酸、β-PGG及柯里拉京的含量并分析。结果毛诃子中单宁酸含量随pH增大而增加;没食子酸含量随pH增大而变化不明显;β-PGG含量随pH增大而减小;柯里拉京含量随pH增大而减小。结论通过研究不同pH条件下毛诃子中的Tannins、GA、β-PGG及Corilagin的含量变化,可为毛诃子中相关成分的质控提供一定理论参考。

响应曲面法优化夏枯草中熊果酸的超声提取工艺

目的采用响应曲面法的Box-Behnken效应面法建立数学模型,优化夏枯草中熊果酸的超声提取工艺。方法以料液比、超声提取时间、乙醇体积分数为考察因素,采用反向高效液相色谱法检测不同条件下夏枯草中熊果酸的含量。结果夏枯草中熊果酸的最优提取工艺为:料液比(g·mL^(-1))1∶5,超声提取时间1.5 h,乙醇体积分数100%,此工艺条件下,熊果酸的含量为0.623 2 mg·g^(-1),与预测值0.611 8 mg·g^(-1)相差较小。结论通过响应曲面法得到了夏枯草中熊果酸提取的优化条件,响应曲面法准确、可靠、可行性强、实用性好。

光生物调节通过抑制氧化应激和继发炎症促进脊髓损伤修复

目的验证体内可埋置激光光纤介导的光生物调节(PBM)对脊髓损伤(SCI)的修复作用。方法SD雄性大鼠随机分为Sham组、SCI组、SCI+PBM组,在T10节段对脊髓进行钳夹损伤。SCI+PBM组在损伤后进行14 d激光照射。通过Western blotting检测组织氧化应激水平,ELISA检测炎性因子及神经生长因子(NGF)含量,免疫荧光染色及TUNEL染色判断神经生长及细胞凋亡,BBB评分及足印记评估运动功能恢复。结果①转录因子Nrf2水平在损伤后降低,光照治疗后Nrf2水平相比于SCI组明显上升(P<0.05);抗氧化酶HO-1在光照后与SCI组相比也明显上升(P<0.05)。②SCI组炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平与Sham组相比明显上升(P<0.01),SCI+PBM组炎性因子水平与SCI组相比明显降低(P<0.05);SCI+PBM组NGF、脑源性神经营养因子含量与SCI组相比明显升高(P<0.05)。③SCI组MAP2荧光强度较Sham组相比明显下降(P<0.01),而SCI+PBM组荧光强度与SCI组相比明显升高(P<0.05);光照干预后TUNEL阳性细胞数较SCI组相比明显降低(P<0.01)。④足印记提示SCI组步宽较Sham组相比明显变大(P<0.01),SCI+PBM组步宽与SCI组相比明显下降(P<0.05);HE染色提示光照治疗后,SCI+PBM组空洞面积明显小于SCI组(P<0.01);BBB评分提示第14日时,SCI组与SCI+PBM组差异性明显(P<0.01)。结论体内可埋置光纤能够通过光生物调节促进SCI后的组织修复和功能恢复。

体内埋置光纤介导的光生物调节对脊髓损伤后小鼠继发性炎症反应和功能恢复的影响

目的研究体内埋置光纤介导的光生物调节对脊髓损伤小鼠组织修复和运动功能恢复的影响。方法构建小鼠T9节段钳夹损伤及光生物调节治疗模型,将小鼠随机分为假手术(Sham)组、脊髓损伤(SCI)组、光生物调节治疗(SCI+PBM)组。用实时荧光定量PCR(qPCR)和酶联免疫吸附测定(ELI⁃SA)法检测损伤区炎症因子的表达情况。免疫荧光染色及原位末端标记(TUNEL)法观察损伤区神经元存活和轴突再生情况。采用巴索小鼠量表(Basso mouse scale,BMS)及足印记评估脊髓损伤小鼠后肢运动功能恢复情况。结果与SCI组比较,SCI+PBM组小鼠损伤区的白细胞介素-1α(interleukin⁃1α,IL⁃1α)、白细胞介素-1β(interleukin⁃1β,IL⁃1β)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor⁃α,TNF⁃α)的表达水平显著降低(P<0.01),总凋亡和神经元凋亡百分比显著降低(P<0.001),轴突到损伤中心的距离显著缩小(P<0.001),BMS评分和足印记步长明显优于SCI组(P<0.01)。结论体内埋置光纤介导的光生物调节可抑制小鼠脊髓损伤区继发性炎症反应,促进损伤区神经元存活及轴突再生,并最终促使损伤小鼠后肢运动功能的恢复。

光生物调节治疗脊髓损伤的研究进展

脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)的治疗是世界性的临床难题,且目前尚无有效的治疗手段。SCI根据病理阶段可以分为原发性损伤和继发性损伤。原发性损伤是指直接由物理伤害本身造成的损伤,以脊髓组织内神经元和非神经元细胞快速死亡为特征,并伴有血脊髓屏障破坏和严重出血,这种损伤是不可逆的。继发性损伤伴随原发性损伤产生,主要表现为强烈的炎症反应、组织水肿、星形胶质增生和神经元变性而导致细胞死亡和鞘磷脂丢失,最终在损伤区形成神经胶质瘢痕。由于该过程呈渐进性发展且具有可逆性和可控性,因此减轻脊髓继发性损伤对改善SCI整个病程和预后十分关键。光生物调节(photobiomodulation,PBM)作为一种古老的治疗手段具有缓解疼痛、减轻炎症以及促进受损细胞和组织修复的作用。此外,PBM在抑郁行为、认知障碍、记忆力下降方面也显示出良好的治疗效果。目前,PBM已被用于治疗创伤性脑损伤、缺血性中风、阿尔兹海默症、帕金森病和SCI。但PBM在SCI方面研究相对较少。笔者就PBM治疗SCI的研究进展进行综述,以期为将来PBM治疗SCI的临床应用研究提供参考。

miR-205-5p通过抑制UHRF1表达促进大鼠周围神经再生的研究进展

目的 探讨周围神经损伤后微小RNA-205-5p(miR-205-5p)的表达情况及miR-205-5p是否具有调控周围神经修复和再生的作用。方法 选取0~2d龄雄性SD大鼠10只,质量5~6g,平均5.7g,用于提取背根神经节细胞;选取雄性SD大鼠30只用于体内实验,6~8周龄,质量200~240g,平均214.6g。钝性分离麻醉后的SD大鼠左后肢皮肤及肌肉,暴露坐骨神经,在靠近背根神经节一端距离坐骨神经分叉处1cm的位置用止血钳挤压10s,将肌肉和表皮进行缝合。采用实时荧光定量PCR法(Q-PCR)检测miR-205-5p在损伤和未损伤大鼠的背根神经节(DRG)组织及细胞中的表达情况,通过脂质体法将miR-205-5p(mimics)转入背根神经节细胞(DRGs),以转入阴性对照NC-mimics(negative control-mimics)作为对照组,观察DRGs轴突的生长情况。采用荧光素酶报告基因系统验证miR-205-5p是否直接靶向结合泛素样PHD和环指结构域蛋白1(UHRF1)基因。采用Q-PCR和蛋白印迹法检测过表达miR-205-5p-mimics后对UHRF1 mRNA及蛋白表达的影响。将miR-205-5p-抑制物和UHRF1的小干扰RNA(si-UHRF1)同时转入DRGs,观察DRGs轴突的生长情况。结果 miR-205-5p在损伤的细胞和组织中的表达水平明显低于未损伤的细胞和组织(P<0.05);与对照组相比,miR-205-5p过表达对背根神经节细胞最长轴突和轴突总长度具有明显的抑制作用(P<0.05);荧光素酶报告基因系统验证结果显示,miR-205-5p直接靶向结合UHRF1基因,实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测结果表明,转染miR-205-5p-mimics后背根神经节细胞中UHRF1 mRNA和蛋白的表达水平明显下调(P<0.05);将miR-205-5p-抑制物和UHRF1的小干扰RNA(si-UHRF1)同时转入背根神经节细胞后,抑制UHRF1表达能明显减弱miR-205-5p-抑制物对背根神经节细胞轴突的促进作用(P<0.05)。结论 miR-205-5p通过调节UHRF1来调节大鼠周围神经修复与再生。