抗人CD33单克隆抗体(HIM3-4、WM53、M195)抗原识别表位的初步研究

目的：确定抗人CD33单克隆抗体（HIM3-4、WM53、M195）抗原识别表位所在区域，进而阐明抗体识别表位不同于其介导的生物学作用之间的关系。方法：将四个CD33胞外区不同长度的基因片段定向克隆入真核表达载体pDisplay，构建成真核表达载体pDisplay／EP1、2,3、4，分别将空载体和构建的质粒通过磷酸钙沉淀法转染入293T细胞，瞬时转染48小时后利用流式细胞仪通过抗血凝素A（HA）抗体标记以检测各质粒在细胞表面的表达，同时检测HIM3-4、WM53、M195和不同区段的结合活性。结果：抗人CD33单克隆抗体HIM3-4能识别pDisplay／EP1、2、3表达的蛋白，WM53能识别pOisplay／EP1表达的蛋白，M195则均能识别四个片段所表达的蛋白。结论：HIM3-4、WM53、M195识别的CD33抗原表位分别位于115—170、17—60、170—262氨基酸。

抗人CD33单链抗体的基因构建、表达及其生物活性检测

目的:构建及表达抗人CD33单链抗体(抗CD33-scFv)基因,并检测其生物活性。方法:采用RT-PCR方法从分泌抗人类白细胞表面分化抗原CD33单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞中克隆出VL和VH可变区基因,再通过重叠延伸拼接(splice-overlap extension)PCR方法在VH和VL可变区基因之间引入柔性连接肽(Gly4Ser)3,体外构建抗人CD33-scFv基因。将其克隆至原核表达载体PET-28a(+)并在大肠杆菌Rosetta(DE3)中表达。结果:SDS-PAGE和Westernblot分析结果表明,抗CD33-scFv在Rosetta(DE3)菌中获得高效表达,重组蛋白的相对分子质量(Mr)为30000,表达产物以不溶性包涵体形式存在,经过溶解包涵体,镍柱亲和层析纯化和体外复性过程,获得了高纯度的scFv片段。流式细胞术(FCM)分析结果证实抗CD33-scFv可与人类白细胞表面的分化抗原CD33结合,保留了鼠源性mAb的与CD33结合的活性。结论:重组抗人CD33-scFv基因构建与表达成功,并且通过复性得到有生物活性的scFv,为下一步针对髓系恶性肿瘤的靶向治疗奠定了基础。