实验性根尖周炎模型大鼠髓样分化因子88的表达

背景:研究发现大鼠牙卵泡中髓样分化因子88有表达,并影响牙齿的萌出和破骨细胞数量。目的:进一步验证髓样分化因子88在大鼠根尖周炎动物模型中的表达。方法:选取6周龄雄性SD大鼠25只,由大连医科大学SPF动物实验中心提供。将大鼠下颌第1磨牙开髓,建立大鼠实验性根尖周炎模型,并将开髓0周作为对照组;开髓1,2,3,4周作为实验组。开髓后于各时间点随机选取5只大鼠,麻醉后取材,用多聚甲醛固定下颌骨,组织脱钙,制作冷冻切片。分别用苏木精-伊红染色、免疫组织化学染色观察根尖组织炎症区域的病理变化,并用RT-PCR检测髓样分化因子88在实验性根尖周炎模型中的表达。结果与结论:(1)苏木精-伊红染色:结果显示实验组的根尖区有炎症浸润,并向周围蔓延扩展,表明成功建立了大鼠实验性根尖周炎动物模型;(2)免疫组织化学染色:结果显示髓样分化因子88在1,2,3,4周4个时间点根尖周炎症区域中均呈阳性表达,髓样分化因子88阳性细胞的表达量在1-3周明显增加,并在第3周时出现高峰;而在4周时,其表达量降低;仅少量髓样分化因子88阳性细胞出现在正常对照组;(3)RT-PCR结果显示髓样分化因子88 mRNA表达量从1-3周逐渐增高,到第4周下降;(4)结果说明,在实验性根尖周炎的动物模型中髓样分化因子88有表达,并随时间呈一定的表达趋势,髓样分化因子88可能参与了根尖周炎的发生及根尖牙槽骨的吸收。

丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶促进慢性根尖周炎模型小鼠的骨破坏

背景:根尖周炎的主要表现为骨破坏和形成炎症性肉芽组织,研究发现丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(AKT)可促进破骨细胞分化。目的:观察AKT在小鼠实验性根尖周炎组织中的表达变化。方法:选用25只C57BL/6J野生型雌性小鼠,通过双侧下颌第一磨牙开髓后将髓腔暴露于口腔中的方法,建立小鼠根尖周炎动物模型。将5只未开髓的小鼠作为健康对照组,其余20只作为实验组,开髓后1,2,3,4周每周随机处死5只小鼠,分离下颌骨,制作冰冻切片。采用苏木精-伊红染色,观察小鼠根尖组织炎症情况;采用免疫组织化学染色,观察AKT的表达与分布情况;采用酶组织化学染色,观察根尖组织破骨细胞的表达,并分析AKT与破骨细胞表达的相关性。结果与结论:①苏木精-伊红染色结果显示:健康对照组小鼠根尖周围组织仅见少量炎性细胞,牙周组织完整;开髓术后1周,根尖周组织牙周膜有少量增宽,有小范围的中性粒细胞浸润;开髓术后2周,牙周膜宽度明显增大,根尖周围组织可见大量的中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞浸润,出现了明显牙槽骨吸收;开髓术后三四周,炎症范围继续扩大,主要为淋巴细胞浸润,牙槽骨的吸收范围更加明显,牙周膜宽度继续增宽;说明小鼠慢性根尖周炎动物模型建立成功;②AKT免疫组织化学染色结果显示:健康对照组仅有少量阳性细胞表达;实验组AKT的表达量在开髓后1周时开始增多;开髓后2周时达到高峰;三四周时数目下降;各实验组AKT阳性细胞数均高于健康对照组,1周与4周之间相比差异无显著性意义(P>0.05),其余各组间差异均有显著性意义(P<0.05);③酶组织化学染色结果显示:破骨细胞数目随着时间延长而呈现一定的趋势,在开髓后二三周时达到高峰;4周时下降;AKT吸光度值与破骨细胞计数值之间存在中度相关性(r=0.634,P<0.001);④提示AKT在小鼠慢性根尖周炎中有表达,且表达增高;AKT参与了慢性根尖周炎的疾病过程,并可能对根尖周炎骨破坏起促进作用。

粪肠球菌脂磷壁酸作用的炎症微环境下磷脂酶Cγ表达研究

目的:研究在粪肠球菌脂磷壁酸(lipoteichoic acid,LTA)作用的炎症微环境下,成骨和破骨细胞中磷脂酶Cγ(phospholipase c-gamma,PLCγ)和活化T细胞核因子1(nuclear factor-activated T cell 1,NFATC1)mRNA的表达。方法:将小鼠RAW264.7及MC3T3-E1分别诱导为破骨细胞和成骨细胞。免疫荧光观察LTA作用破骨细胞及成骨细胞后PLCγ和NFATC1的定位。实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative Real-time PCR)检测LTA作用破骨细胞和成骨细胞后PLCγ和NFATC1 mRNA的表达。细胞增殖及毒性检测试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)检测LTA作用破骨细胞和成骨细胞后的增殖活性。结果:破骨和成骨细胞诱导成功。免疫荧光检测可见PLCγ定位在胞质,NFATC1定位在胞核;Real-time PCR结果发现LTA刺激后成骨细胞中PLCγ和NFATC1 mRNA表达量明显减少(P<0.05);LTA刺激后破骨细胞中PLCγ和NFATC1 mRNA表达量明显增高(P<0.05);10 mg/L LTA组可抑制成骨细胞增殖,促进破骨细胞增殖(P<0.05)。结论:PLCγ和NFATC1可能在难治性根尖周炎的炎症反应和骨破坏中发挥一定的作用。

布鲁顿酪氨酸激酶对破骨细胞增殖及分化作用的实验研究

目的观察布鲁顿酪氨酸激酶(BTK)对破骨细胞增殖及分化的影响,探讨BTK对根尖周炎骨破坏的作用。方法破骨前体细胞RAW264.7经100 ng·L^-1核因子κB受体活化因子配体(RANKL)诱导5 d后,通过观察细胞形态、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色及实时荧光定量PCR(RT-qPCR)的方法,验证破骨细胞是否诱导成功。破骨细胞诱导成功后,转染BTK-小干扰RNA(siRNA)24 h,利用RT-qPCR检测TRAP mRNA的表达,采用CCK-8和TRAP酶活性检测法检测破骨细胞的增殖及分化情况。结果RAW264.7细胞经RANKL诱导5d后,可见大量体积较大,外观呈圆形、椭圆形,周围有不规则突起及TRAP染色阳性的多核破骨细胞。经BTK-siRNA转染24 h后,破骨细胞TRAP mRNA的表达水平显著降低(P<0.05),其增殖及分化能力也明显受到抑制(P<0.05)。结论抑制BTK表达,可以抑制破骨细胞的增殖及分化;BTK可作为抑制破骨细胞的新靶点。

中药薯蓣皂苷对NLRP3炎性体的作用

目的检测中药薯蓣皂苷是否可以抑制粪肠球菌脂磷壁酸(LTA)所诱导的NLRP3炎性体的活化。方法选用中药薯蓣皂苷作为实验药物,作用于小鼠巨噬细胞RAW264.7,NLRP3炎性体相关因子mRNA的表达用Real-time qPCR方法检测。通过免疫荧光染色检测薯蓣皂苷对NF-κB的表达情况,流式细胞仪检测其对ROS的表达情况。结果 Real-time qPCR试验显示,中药薯蓣皂苷在LTA存在下,可以明显降低NLRP3、Caspase-1及IL-1β的mRNA表达。免疫荧光染色及流式细胞仪的检测证实,其对NLRP3的抑制主要是通过抑制NF-κB的活化及ROS的释放而实现。结论薯蓣皂苷可有效抑制NLRP3炎性体的表达,其机制是通过抑制NF-κB信号通路及ROS的释放而实现。薯蓣皂苷可以作为临床难治性牙髓根尖周病治疗的候选药物。

BTK在粪肠球菌介导的炎症环境中的破骨作用

目的在粪肠球菌脂磷壁酸(LTA)作用的炎症环境下,研究布鲁顿酪氨酸激酶(BTK)在破骨细胞中的作用,从而为根尖周炎的治疗提供实验依据。方法 PCR检测粪肠球菌LTA刺激破骨细胞后BTK基因水平的表达情况。以浓度300ng/mL的人重组蛋白BTK(recombinant human BTK,rhBTK)刺激破骨细胞,用CCK8法检测破骨细胞增殖和RT-PCR检测破骨细胞分化标志因子TRAP基因水平表达情况。结果破骨前体细胞5d诱导成功。PCR结果发现粪肠球菌LTA刺激后BTK和TRAP的mRNA表达量明显增高;免疫荧光可见LTA刺激后BTK在破骨细胞中的定位情况;300ng/mL rhBTK组可以促进破骨细胞增殖;PCR结果显示,加入rhBTK后,破骨细胞分化标志因子TRAP的mRNA水平升高。结论在粪肠球菌LTA作用的炎症环境下,BTK表达升高;增高BTK后,可以促进破骨细胞的增殖及分化。研究发现BTK参与了破骨细胞的炎症反应进程。