耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)重组亚单位疫苗FnBPA的免疫保护作用研究

目的评价耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)候选疫苗抗原FnBPA活性片段的免疫原性以及其在抵抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染中的免疫保护作用。方法构建pGEX-6p-2-FnBPA表达载体,经可溶表达及亲和纯化后的重组蛋白免疫Balb/c小鼠。末次免疫后的第7天,分离免疫小鼠的血清ELISA检测IgG及其亚型抗体水平,同时测定体外抗体介导的调理吞噬作用。末次免疫后的第14天,经尾静脉感染ATCC国际标准株MRSA-252,统计分析感染后各组的小鼠的生存率以及检测脾脏,肾脏的细菌定植量。结果成功构建、表达及纯化了FnBPA活性片段,重组蛋白纯度可达90%;免疫后诱导小鼠机体产生了高效价的IgG抗体,并在体外能发挥抗体介导的调理吞噬作用;在感染保护评价实验中,与对照组相比,实验组的生存率显著提高(P<0.01),并显著降低了脾脏与肾脏的细菌定植量(P<0.05)。结论耐甲氧西林金黄色葡萄球菌重组亚单位疫苗FnBPA具有良好的免疫原性和免疫保护作用,可以作为MRSA疫苗研究的重要候选抗原。

幽门螺杆菌感染的慢性胃炎与凋亡基因的相关性研究

目的探讨幽门螺杆菌(HP)感染相关胃炎程度与胃黏膜细胞凋亡基因表达的相关性。方法将2013年11～12月大坪医院消化内镜中心45例慢性胃炎患者纳入研究,快速尿素酶实验和13 C-呼气实验检测HP感染情况,病理分析HP感染部位胃炎严重程度,实时定量PCR(qRT-PCR)法检测HP感染部位胃黏膜组织和无HP感染的胃黏膜组织中凋亡相关基因Bax、Bak、Bcl-2的表达,Person相关分析HP感染的慢性胃炎程度与凋亡基因表达的相关性。结果 45例患者13 C-呼气实验和胃窦黏膜快速尿素酶实验均阳性,提示HP感染。病理结果显示45例(100%)患者均为慢性胃窦胃炎,其中28例(62.2%)为轻度,16例(35.6%)为中度,1例(2.0%)为重度;9例(20.0%)肠化生,5例(11.1%)低级别上皮内瘤变。45例患者胃体黏膜尿素酶实验阴性,提示无HP感染,其中6例胃体组织显示轻度慢性炎症(13.3%),39例无炎症(86.7%);无肠化生及上皮内瘤变。qRT-PCR结果显示HP感染胃黏膜中Bax mRNA的表达明显高于HP未感染胃黏膜患者(P<0.01)且与胃炎程度呈明显正相关(P<0.01),而Bak和Bcl-2的表达在两组间差异无统计学意义(P>0.05)。结论 HP感染的慢性胃炎程度与胃黏膜细胞凋亡呈正相关,提示HP感染可能导致胃上皮细胞中Bax基因的表达从而促进细胞凋亡。

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌小鼠全身感染模型的建立与评价

目的建立稳定、可靠的MRSA全身感染小鼠模型,为MRSA疫苗的研发提供参考依据,并对系统研究MRSA感染的发病机制及其防治策略奠定实验基础。方法在采用国际标准株MRSA-252建立OD600-CFU标准曲线的基础上,经尾静脉注射途径感染BALB/c小鼠,从感染剂量的选择、小鼠的生存率和体重变化、血液及多脏器的细菌定植量以及主要组织器官病理学变化等多个层面进行时相性监测,对建立的小鼠模型进行系统评价。结果经此途径建立的小鼠模型,致死剂量为每只5.0×109CFU,亚致死剂量为每只1.0×109CFU(生存率为60%～70%)。感染后小鼠生存率下降;体重下降;血液及肝脏、脾脏和肾脏均有细菌定植,定植量在感染后第3天达到高峰;心、肝、肺和肾等主要脏器中有较明显的细胞坏死和炎性细胞浸润。结论小鼠模型的建立,将为进一步研究MRSA疫苗的有效性和安全性评价等提供可靠的技术手段。

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌IsdB活性片段的克隆、表达及抗原免疫保护性初步研究

目的探讨耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)抗原IsdB活性片段(IsdB2)免疫保护作用。方法利用生物信息学技术预测分析出IsdB活性片段(IsdB2),PCR扩增编码IsdB2的基因片段,亚克隆至GST标签融合表达的原核表达载体pGEX-6P-2中,将载体转化入大肠杆菌XL-1 blue,通过IPTG诱导表达IsdB2/GST融合蛋白,利用GST亲和层析初步纯化获取IsdB2蛋白。用IsdB2蛋白抗原辅以氢氧化铝佐剂对小鼠进行免疫实验,统计小鼠存活率对IsdB2抗原的免疫性进行初步研究。结果重组质粒经过BamHⅠ和NotⅠ双酶切鉴定、核酸序列测定和IPTG诱导表达IsdB2/GST及酶切获取IsdB2蛋白的SDS-PAGE分析表明,IsdB2蛋白相对分子质量大小约72 000,GST标签相对分子质量大小约26 000,与预期相符合。用IsdB2蛋白对小鼠进行3次疫苗免疫实验,IsdB2对小鼠的保护率分别为84.6%、50%和60%。结论成功构建重组表达载体pGEX-6P-2-IsdB2,利用大肠杆菌表达系统、GST亲和层析和酶切方法获得IsdB2蛋白抗原,通过3次动物疫苗免疫实验结果表明IsdB2具有免疫保护性,为研制新型有效的MRSA疫苗奠定实验基础。

miR-25在人胃癌组织中的表达分析及其靶基因TOB1的鉴定

目的:分析miR-25在胃癌组织中的表达水平并鉴定其新的靶基因。方法:选取10例胃癌患者的胃癌及癌旁正常组织样本,用qRT-PCR法检测miR-25的表达水平。利用miRNA靶基因预测数据库预测miR-25的靶基因。构建荧光素酶载体(pMIR-TOB1)及绿色荧光蛋白报告载体(pMIR-GFP-TOB1)(含有miR-25结合位点的TOB1的3'UTR片段),利用荧光素酶活性实验和GFP荧光强度报告实验鉴定miR-25的预测靶基因(TOB1)。qRT-PCR法和Western blot法分别检测TOB1的mRNA和蛋白质的表达水平。结果:miR-25在80%(8/10)的胃癌组织样本中表达上调。miR-25模拟物显著抑制了荧光素酶的活性(P<0.01)和GFP荧光强度。miR-25模拟物显著下调了AGS细胞中TOB1的mRNA(P<0.05)和蛋白质的表达。结论:miR-25在人胃癌组织中表达上调,miR-25能结合TOB1的3'UTR并下调TOB1的mRNA和蛋白质的表达。

MicroRNA-30a在胃癌组织的表达分析及其靶基因成纤维活化蛋白α的鉴定

目的分析microRNA-30a(miR-30a)在胃癌中的表达水平并鉴定其新的靶基因。方法选取29例胃癌患者的肿瘤组织和癌旁组织,利用qRT-PCR检测miR-30a的表达。通过miRNA靶基因预测数据库Target Scan预测miR-30a的靶基因。构建含有miR-30a结合位点的3'UTR片段的荧光素酶载体(p MIR-FAPα),通过荧光素酶报告实验对预测靶基因进行检测。利用Western blot和qRT-PCR对预测靶基因成纤维活化蛋白α(fibroblast activation proteinα,FAPα)的表达进行检测。结果 miR-30a在胃癌组织样本中的表达明显下调,通过生物信息学预测(Target Scan)和荧光素酶实验表明miR-30a mimic可与FAPα基因结合,qRT-PCR和Western blot结果表明miR-30a mimic可抑制FAPαmRNA和蛋白质水平的表达。结论 miR-30a在人胃癌组织样本中表达下调,FAPα是其靶基因。

噬菌体展示技术在全人源性抗体发现中的应用

噬菌体展示技术是目前应用最广泛的体外抗体筛选技术,它以噬菌体为载体,将外源抗体库基因插入到噬菌体衣壳蛋白基因中,在噬菌体表面表达衣壳蛋白的同时也展示了抗体分子。抗体药物因靶向优势在肿瘤免疫和病原生物感染中都发挥着重要作用,是其成为医药研发领域热点的重要推动力。因此,本文对噬菌体展示技术的研发背景、基本原理、抗体库构建类型及抗体展示片段类型进行综述,并对基于噬菌体展示的全人源性抗体的最新进展和应用前景进行了展望。

痘病毒对T细胞和B细胞的免疫教育

天花现虽已被根除,但意外或故意释放的威胁并未解除,其致病机理尚不清晰,疫苗免疫后是否能抵御再感染风险未知。且现有的天花疫苗具有不可接受的副作用和其他并发症,因此迫切需要新的疫苗。人类VARV感染的替代动物模型,包括小鼠的牛痘病毒(VACV)和痘病毒(ECTV)感染,猕猴的猴痘病毒(MPXV)感染,已被用于对痘病毒的免疫反应研究。鼠痘是由一种天然的小鼠病原体ECTV引起的,可以说是最好的替代小动物模型,因为它与人类天花在病毒生物学、病理学和临床特征的许多方面具有共同特征。从原发性ECTV感染中恢复的要求已经被很好的阐释,包括I型和II型干扰素、自然杀伤细胞、CD4T细胞、CD8T细胞效应功能和抗体。从疫苗的角度来看,也必须确定从继发感染中恢复的要求。通过研究宿主对继发性ECTV感染的免疫参数,并确定干扰素和CD8T细胞效应功能不是必需的;然而,T细胞和B细胞的相互作用和抗体对于从再次感染中恢复是绝对关键的。抗体在再次感染中的中心作用也已被确定。这些发现具有重要的临床意义,并将极大地帮助天花治疗干预措施和新疫苗的设计。

幽门螺杆菌毒力因子CagA通过靶向SHARPIN促进炎症反应的机制研究

目的幽门螺杆菌(H.pylori)引起的慢性炎症是胃癌的主要原因之一,本研究旨在探讨幽门螺杆菌的重要毒力因子细胞毒素相关蛋白A(CagA)促炎的作用及其调控机制。方法采用质谱鉴定CagA在AGS细胞内的相互作用蛋白,并通过免疫共沉淀、免疫荧光验证其相互作用。通过使用siRNA敲低后,免疫印迹法检测通路蛋白表达、qRT-PCR检测炎症因子mRNA水平、ELISA检测蛋白水平。使用血红素-伊红染色法(H&E)检测临床样本中CagA诱导的炎症反应。结果CagA与SHARPIN具有相互作用。与CagA敲除株相比,CagA激活了NF-κB信号通路并上调了炎症因子IL-6、IL-8、TNF-α的mRNA水平和蛋白表达(P均<0.05)。通过siRNA敲低SHARPIN后,炎症水平降低、NF-κB信号被部分抑制。临床样本中CagA^(+)样本炎症反应显著增加。结论CagA促进宿主炎症反应,干扰SHARPIN可部分抑制CagA所致炎症反应,表明CagA通过与SHARPIN结合这一新机制激活NF-κB信号通路促炎。

幽门螺杆菌空泡毒素VacA促进胃上皮细胞NLRP3炎性小体激活

目的探究H.pylori空泡毒素VacA对胃上皮细胞NLRP3炎性小体激活的影响。方法采用WT H.pylori26695和△VacA H.pylori26695感染AGS细胞,Western blotting、qRT-PCR、ELISA检测NLRP3、Pro-Caspase-1、Caspase-1、pro-IL-1β和IL-1β的表达。siRNA-NC、siRNA-NLRP3转染AGS后,分别用PBS、WT H.pylori26695和△VacA H.pylori26695刺激,qRT-PCR和细胞因子ELISA检测试剂盒分别检测pro-IL-1β的mRNA表达水平和IL-1β的蛋白表达水平。收集慢性胃炎患者标本,鉴别出H.pylori阳性患者的VacA基因型(s1m1型和s1m2型),通过qRT-PCR检测NLRP3、caspase-1、pro-IL-1β的mRNA表达水平及采用细胞因子ELISA试剂盒检测IL-1β蛋白表达水平。C57BL/6小鼠腹腔注射DMSO或者DMSO+Mcc950,H.pylori菌液灌胃,qRT-PCR和ELISA检测胃组织IL-1β的表达。结果H.pylori感染AGS细胞,与对照组相比,WT H.pylori26695组IL-1β的mRNA和蛋白表达水平均明显升高(P<0.01);△VacA H.pylori26695组与WT H.pylori26695组相比,IL-1β的mRNA和蛋白表达水平均明显下降(P<0.01)。与siRNA-NC组相比,采用WT H.pylori26695和△VacA H.pylori 26695刺激转染siRNA-NLRP3的AGS细胞pro-IL-1β的mRNA水平和IL-1β蛋白表达水平均明显下调(P<0.01)。H.pylori阳性患者较阴性患者NLRP3、Caspase-1和IL-1β的mRNA表达水平明显升高(P<0.01);与VacA s1m2型患者相比,VacA s1m1型患者NLRP3、Caspase-1和IL-1β的mRNA表达水平显著升高(P<0.01),同时IL-1β成熟分泌增加。H.pylori慢性胃炎小鼠动物模型中,与对照组相比,Mcc950组中在WT H.pylori26695和△VacA H.pylori26695灌胃后,pro-IL-1β的mRNA水平和IL-1β蛋白水平表达均明显下调(P<0.01)。结论H.pylori空泡毒素VacA能够激活胃上皮细胞NLRP3炎性小体,促进IL-1β的成熟分泌。

《生物技术制药》第二课堂在提高学生学习兴趣和科研素质中的作用

《生物技术制药》作为生物技术专业学生和药学专业学生的主干课程之一,在培养高素质创新型医药人才中发挥举足轻重的作用。因其课程特点,需要高等医学药学院校对课程不断地进行改革尝试。第二课堂是对主课堂教学活动的延伸、补充和发展,在提高学生综合素质方面发挥着重要作用。该研究通过对陆军军医大学93例参加《生物技术制药》第二课堂的学生进行调查,发现参加《生物技术制药》第二课堂学习后学生学习兴趣和科研素质得到显著提高,值得广泛推广。

外膜囊泡医学应用研究进展

外膜囊泡(OMV)是细菌自然生长的产物,呈球形双层膜纳米结构,其表面包含众多PAMPs,与免疫应答相关。OMV具有免疫原性和固有佐剂活性,因此可作为疫苗或单独的疫苗佐剂使用。OMV的中空结构可以作为药物储存载体,同时利用其外部结构实现药物的靶向作用。OMV在医学领域研究甚广,但要充分发挥其功能须清楚了解其研究进展和作用机制。本文通过对OMV在医学方面的应用进行简要综述,以便研究者快速获得此领域进展信息。

建立幽门螺杆菌感染动物模型需考虑的因素

幽门螺杆菌感染具有普遍性和长期性,感染后若不治疗,将持续存在并对胃的生理造成影响,从而引发各种疾病。目前幽门螺杆菌治疗主要以抗生素为主,随着耐药率上升,疫苗成为理想的对抗手段。在幽门螺杆菌疫苗的研究工程中,动物模型的建立至关重要。本文通过查阅文献,简要综述幽门螺杆菌感染模型建立需考虑的因素,根据菌株特性确定感染使用的菌株,再根据菌株确定动物种属,然后再细化感染细节,从而使模型更接近于人类感染情况,才能进一步验证疫苗的安全性和有效性,促进幽门螺杆菌疫苗的研发。

囊型棘球蚴病Antigen 5 iELISA检测方法的建立和应用

目的 基于Antigen 5(Ag5)建立一种具有较高灵敏度和特异度的检测囊型棘球蚴病(CE)的间接酶联免疫吸附试验(iELISA)法。方法 构建pGEX-6p-2-Ag5表达载体,经表达及亲和纯化后的重组蛋白作为包被抗原,经过标准品血清的检测,确定其临界值。对184例CE患者按照感染时期,包囊数量、状态,是否接受药物及手术治疗分组,利用建立的iELISA法进行检测,并与商品化试剂盒方法比较。结果 当临界吸光值(A)比值为0.46时,该iELISA法具有最佳的灵敏度(91.6%)和特异度(96.3%)。处于过渡期(CE3a、CE3b)的CE患者血清中含有较高水平的特异性抗体。iELISA方法对于CE4和CE5期患者的阳性率分别为83.3%和63.0%,明显高于商品化试剂盒检测的阳性率(P<0.05);iELISA方法对于健康人血清的检测,阳性率为2.4%。另外,活性包囊、多包囊以及经过药物治疗的CE患者具有更高的阳性率。结论 该研究建立的iELISA法具有较高的灵敏度及特异度,为CE患者的临床诊断提供了一种有价值的检测手段。

YAP/TAZ对发育和肿瘤的调控及其功能的研究进展

Hippo通路是一种在进化中形成的保守的蛋白激酶级联通路,它与发育中器官的大小和肿瘤的形成有关。Hippo通路的中枢是从肿瘤抑制子Hippo到原癌蛋白YAP/TAZ的激酶级联反应。YAP/TAZ是Hippo通路下游的主要的效应分子,它们广泛表达于多种组织器官中。在哺乳动物细胞中,Hippo通路激酶级联反应通过对YAP/TAZ磷酸化作用,促使其从细胞核转入细胞质中,从而抑制了YAP/TAZ的功能作用。TEAD家族转录子被鉴定为YAP/TAZ发挥生物学功能的重要调节因子。YAP/TAZ的失调引起的相关的基因的表达改变,将会影响细胞的增殖,分化,以及凋亡,从而会影响器官的大小以及肿瘤的形成。本文综述Hippo通路的最新进展,重点关注的是该通路中的YAP/TAZ调控的缺失对发育缺陷和肿瘤的影响。这将为我们研究再生医学,组织工程技术,肿瘤的干预防治提供新的思路与策略。

幽门螺杆菌分泌与重组表达的VacA蛋白的分离纯化及其致细胞空泡效应与凋亡的对比研究

目的分离纯化幽门螺杆菌分泌和重组表达的细胞空泡毒素抗原(VacA)蛋白,并评价其致细胞空泡效应及致细胞凋亡效应。方法分别从幽门螺杆菌ATCC26695菌株培养上清和重组表达VacA蛋白的pQE30-VacAE.coliM15基因工程菌中分离纯化VacA蛋白,经酸化后,以不同终浓度(5,10 ng/ml)分别与人胃腺癌AGS细胞共孵24 h,观察致空泡效应,并通过流式细胞术检测细胞凋亡。结果成功分离纯化出幽门螺杆菌分泌和重组表达的VacA蛋白;幽门螺杆菌分泌的VacA蛋白能显著引起AGS细胞的空泡样改变及凋亡(P<0.01),而重组表达的VacA蛋白致细胞空泡样改变及凋亡不显著(P>0.05)。结论幽门螺杆菌分泌的VacA蛋白有良好的空泡毒性及致凋亡效应,而重组表达的VacA蛋白无致空泡及凋亡效应,幽门螺杆菌分泌的VacA蛋白可用于VacA作用机制的研究。

ECM和YAP/TAZ在决定细胞命运的过程中的作用机制

近年来,有研究表表明从细胞微环境中转化而来的机械信号可以调控细胞形状和影响细胞的命运。然而,这些机械信号转化成调节细胞生物过程的信号的机制仍然不是十分清楚。最新研究已阐明细胞可通过来自细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的机械信号和细胞行为调控之间的相互作用来募集Hippo信号通路中的核心组件YAP/TAZ的作用机制。此外,研究发现在Wnt和Hippo信号之间的串扰是调节细胞命运的核心。这些机制可以解释力学微环境的信号是如何调节细胞行为和决定细胞命运的。本文重点对ECM和YAP/TAZ在决定细胞命运的过程中的作用机制展开系统综述。

长非编码RNA在基因调控和肿瘤形成中的作用

哺乳动物中,只有小部分基因转录成为编码蛋白质的RNA,大量的基因则转录为不能编码蛋白质的RNA,即nc RNA。长非编码RNA(lnc RNAs)是分子长度在200-100000 nt之间的一类nc RNA。lnc RNAs的数量超过蛋白质编码基因的数量。目前,对长非编码RNA(lnc RNAs)的生物学特性,转录调控以及其在肿瘤发生发展中的作用机制的研究任然是RNA研究的热点。lnc RNAs通过控制染色质重塑,转录调控和录转录后调控而在基因的转录调节中发挥了重要作用。lnc RNAs与多种肿瘤相关,并且在抑制因素和促进因素中都具有重要的作用。众多文献报道的结果表明lnc RNAs参与调控基因表达,在正常细胞与肿瘤细胞的转换中起到至关重要的作用。

基于学习金字塔的“五步循环”模式在检验实习教学的应用

随着大量全自动、高通量、高性能的各种联合体外诊断检测仪器设备试剂的发展,“大检验”时代概念的到来,促进了各大医学院校的检验教学改革,然而,实习阶段的教学却常常未被纳入改革内容,而实习又是医学检验教学的重要阶段和有机组成部分,是全面实现培养目标的关键教学环节。在这一阶段,如何让医学生能够把所学的理论知识和临床操作紧密结合,提高自主学习能力、职业责任心、团队协作能力,