TGF-β与器官纤维化的研究进展

转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)是一种能使正常的成纤维细胞的表型发生转化的生长因子,其在肾小管间质纤维化的过程中扮演重要角色。TGF-β的特点是分布广、影响大。在哺乳动物中至少发现有4种TGF-β亚型,在人体内大多数细胞都可以合成TGF-β,其信号转导通路主要有Smad和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)两条途径,主要功能为抑制细胞增殖,促进细胞外基质积聚。当肾小管间质发生纤维化时,细胞外基质(ECM)沉积增多,是导致慢性肾功能衰竭的原因之一。肾间质纤维化是各种肾脏疾病发展到肾衰竭的共同途径及病理基础。持续的肝损伤会导致肝脏大面积纤维化而引起肝硬化。肾间质纤维化与肝纤维化时,TGF-β也起到了很重要的作用。本文旨在关于TGF-β功能、TGF-β相关受体信号转导通路及其肾小管间质纤维化和肝纤维化相关的研究进展进行探讨,并对TGF-β相关受体在临床应用方面进行了简要的展望。

TGF-β1诱导乳腺癌细胞上皮-间充质转化中相关miRNAs筛选

目的:探讨转化生长因子β1(TGF-β1)诱导乳腺癌细胞MCF-7上皮-间充质转化(epithelialmesenchymal transition,EMT)的最佳浓度以及miRNAs在其中的差异表达。方法:不同浓度的TGF-β1作用于MCF-7细胞48h,光学显微镜下观察MCF-7细胞形态学的变化,同时Real-time PCR检测MCF-7细胞中上皮和间充质标志物表达变化;进一步利用Real-time PCR对通过生物信息学挑选的差异表达的miRNAs进行验证。结果:10ng/ml的TGF-β1作用MCF-7细胞48h后,能诱导MCF-7细胞发生EMT转化,同时筛选出与EMT密切相关的4个miRNAs(miR-16,miR-196a,miR-196b和miR-21)。结论:miR-16、miR-196a、miR-196b和miR-21在TGF-β1诱导的EMT细胞模型中表达上调,发现这4个miRNAs与TGF-β1诱导的EMT密切相关。

骨髓间充质干细胞在肺纤维化中作用的研究进展

肺纤维化是多种病因引起一种慢性炎症间质性肺疾病。临床经验证实,激素、免疫抑制剂、细胞毒药物、抗纤维化药物以及免疫调节剂等药物治疗对肺纤维化疗效并不理想。因此探明肺纤维化的发病机制进而寻找有效的治疗方法显得尤为重要。近年来骨髓间充质干细胞移植作为新型的生物治疗方法已成为医学领域中最热门的研究课题之一,研究表明骨髓间充质干细胞可通过抑制炎性反应、促进上皮组织修复、减少胶原沉积、抑制基质金属蛋白酶的表达等来减轻肺纤维化,其凭借特有的生物学特性及功能成为治疗肺纤维化的种子细胞。但有些研究则发现骨髓间充质干细胞植入时机与疗效的差异具有相关性。因此本文就骨髓间充质干细胞在肺纤维化中的作用作一综述。

miR-1与糖尿病心肌肥大的相关性

目的探讨糖尿病心肌病心肌肥大与miR-1表达量之间的关系。方法给C57BL/6小鼠腹腔注射链脲佐菌素(STZ),建立糖尿病心肌病心肌肥大模型,8周后取心脏组织并称其重量,提取RNA并逆转录,用qRT PCR检测miR-1的表达,检测糖尿病模型小鼠心脏组织中的相关靶基因BNP和ANP并确定糖尿病心肌病心肌肥大模型建立成功。培养大鼠心肌细胞H9C2细胞,对细胞进行高糖和低糖处理,24h后收集细胞,提取RNA并逆转录,用qRT PCR检测miR-1的表达。收集正常人血清,1型和2型糖尿病病人血清以及1型糖尿病心肌肥大病人血清,检测血清中miR-1的表达。Western blot检测高糖和低糖处理24h的H9C2细胞中p-Akt和AKT的表达。向H9C2细胞中加入Akt抑制剂LY294002,qRT PCR检测miR-1的表达量。结果 qRT PCR检测发现糖尿病心肌肥大小鼠心脏组织中的miR-1的表达降低,高糖处理的H9C2细胞中miR-1的表达降低,1型糖尿病心肌肥大病人血清中的miR-1的表达降低。Western blot检测发现高糖处理的H9C2细胞中pAkt和AKT的表达升高,当加入Akt抑制剂LY294002时,qRT PCR检测发现miR-1的表达量升高。结论糖尿病心肌肥大时,miR-1起到了关键作用,并且糖尿病心肌肥大的心脏组织中PI3K-Akt信号通路明显抑制了miR-1的表达。

截短型人转化生长因子βⅡ型受体胞外域的表达及活性分析

目的构建截短型人转化生长因子βⅡ型受体胞外域(thTβRⅡ)原核表达载体,诱导表达纯化thTβRⅡ蛋白,并分析其生物学活性。方法以本实验室前期构建的TβRⅡ全长基因片段(p GEX-4T1-TβRⅡ)为模版,常规PCR扩增出带有Nde I和Bam HI酶切位点的thTβRⅡ目的基因,并插入原核表达载体p ET28a,命名为p ET28a-thTβRⅡ。将经过PCR、双酶切和DNA测序正确的p ET28a-thTβRⅡ转化至大肠杆菌Rossta诱导表达,用Ni^(2+)亲和层析纯化获得高纯度thTβRⅡ目的蛋白,经SDS-PAGE进行纯度分析,MTT法观察其对转化生长因子-β1(TGF-β1)活化的人肝星状细胞LX-2增殖活性的影响,real-time RT-PCR及Western blot检测其对TGF-β1、纤连蛋白(FN)mRNA及FN、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)蛋白表达的影响。结果 p ET28a-thTβRⅡ原核表达载体构建成功,宿主菌Rossta/p ET28a-thTβRⅡ在37℃经0.8mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导5 h获得目的蛋白thTβRⅡ的大量表达,目的蛋白主要以包涵体的形式存在,通过Ni^(2+)亲和层析成功获得高纯度thTβRⅡ,SDS-PAGE鉴定分子量约为18.0 kD,MTT显示150μg/mL的重组蛋白thTβRⅡ能明显抑制活化的人肝星状细胞LX-2增殖,real-time RT-PCR及Western blot显示200μg/mL的重组蛋白thTβRⅡ其能显著减少TGFβ1、FNmRNA;FN、α-SMA蛋白的表达。结论成功构建thTβRⅡ原核表达载体,诱导表达纯化并获得高纯度重组蛋白thTβRⅡ,其能抑制活化的LX-2细胞增殖并具有抗纤维化作用,为进一步体内外功能研究打下基础。

TGF-β1和TGF-βⅡ型受体酵母表达载体构建

目的克隆人转化生长因子β1(TGF-β1)和4个受体基因片段,构建酵母表达载体,为应用酵母双杂交筛选与TGF-β1相互作用的TβRⅡ区域提供技术支持。方法提取人血液中RNA,逆转录转为c DNA,PCR扩增TGF-β1和4个受体(TβRⅡ-A、TβRⅡ-B、TβRⅡ-C、TβRⅡ-D)基因片段,双酶切后,分别插入酵母双杂交表达载体p GBKT7和p GADT7;经过PCR扩增、双酶切和DNA测序鉴定后,构建质粒p GBKT7-TGF-β1和p GADT7-TβRⅡ-A、p GADT7-TβRⅡ-B、p GADT7-TβRⅡ-C和p GADT7-TβRⅡ-D。结果成功扩增TGF-β1基因(1 200 bp)和TβRⅡ-A(453bp)、TβRⅡ-B(366 bp)、TβRⅡ-C(276 bp)和TβRⅡ-D(165 bp)基因片段,经PCR、双酶切和DNA测序鉴定插入到酵母双杂交载体序列正确。结论成功构建p GBKT7-TGF-β1和p GADT7-TβRⅡ-A、p GADT7-TβRⅡ-B、p GADT7-TβRⅡC和p GADT7-TβRⅡ-D酵母双杂交表达载体。

柚皮苷对H_2O_2诱导H9c2心肌细胞损伤保护作用

目的探讨柚皮苷对H_2O_2诱导的H9c2心肌细胞凋亡的保护作用及机制。方法体外培养H9c2心肌细胞,用H_2O_2诱导建立细胞凋亡模型。实验设对照组、模型组、柚皮苷低、中、高剂量组(10、20、40μmol/L),噻唑蓝法检测细胞活力并用显微镜观察各组细胞形态;原位末端标记法检测H9c2心肌细胞凋亡情况;RT-PCR及Western blot法检测凋亡相关因子Bcl-2、Bax、caspase-3 m RNA及蛋白表达。结果与对照组比较,模型组细胞凋亡率[(17.2±2.1)%]明显升高(P<0.01);与模型组比较,10、20、40μmol/L柚皮苷组细胞凋亡率[分别为(10.7±1.9)%、(5.7±1.2)%、(6.4±1.5)%]均下降(均P<0.05)。与对照组比较,模型组H9c2心肌细胞Bcl-2蛋白表达水平(0.76±0.16)明显下调,Bax、caspase-3蛋白表达水平[分别为(5.42±0.52)、(1.09±0.11)]均上调(均P<0.01);与模型组比较,10、20、40μmol/L柚皮苷组H9c2心肌细胞Bcl-2蛋白表达水平[分别为(1.37±0.11)、(1.65±0.09)、(1.65±0.15)]均上调,Bax、caspase-3蛋白表达水平[分别为(2.78±0.55)、(3.43±0.15)、(2.69±0.26)和(0.59±0.08)、(0.77±0.06)、(0.82±0.05)]均下调(均P<0.05)。结论柚皮苷对H_2O_2诱导的H9c2心肌细胞损伤具有一定保护作用,其机制可能与其对凋亡信号途径的抑制作用有关。