葡萄霜霉菌株的收集及侵染12个葡萄品种后症状差异分析

葡萄霜霉病的广泛传播会对我国葡萄的产量及质量造成极大的危害。为了科学地防治葡萄霜霉病的传播,从江苏、浙江和上海等长三角省(市)的葡萄栽培区采集编号为BS的霜霉菌菌株样品进行鉴定,之后以12个葡萄品种为寄主材料进行致病力试验。将霜霉菌株侵染葡萄后的表型划分为5类:易感病(A型)、感病(B型)、较感病(C型)、较抗病(D型)、抗病(E型)。结果表明,17份菌株的致病力程度多在A型到C型之间,具有欧亚种背景的葡萄品种对所有菌株均较感病,其中以紫甜无核和黑比诺最为感病(A型);3种砧木葡萄对其中12份菌株较为抗病,叶片侵染部位有超敏反应的坏死斑点,其中以砧木Kober 5BB最抗病(E型);具有欧美杂交背景的品种抗病性居中,其中以夏黑和阳光玫瑰较为抗病(D型)。为了验证该分级系统的可行性,挑选了E型葡萄品种砧木Kober 5BB和A型葡萄品种紫甜无核进行进一步的致病力测试和霜霉孢子囊形态观察,发现试验结果一致。该研究为不同遗传背景的葡萄抗病杂交育种提供了一定的理论基础。

葡萄类TIAR基因的克隆及其在胚珠发育过程中的表达分析

【目的】研究葡萄类TIAR蛋白与无核葡萄胚珠败育的关系,探索无核葡萄胚珠败育分子机理。【方法】以‘无核白’葡萄(Vitis vinifera‘Thompson Seedless’)浆果发育过程中差异表达的EST序列为基础,克隆目的基因全长序列,并通过实时荧光定量PCR技术分析了该基因在无核葡萄品种‘无核白’和有核葡萄品种‘黑比诺’胚珠发育过程中的表达变化。【结果】获得一条1 593 bp的同源序列,命名为VvTIAR-like(GenBank登录号:KF523863),其ORF长1 269 bp,编码422个氨基酸,蛋白理论分子质量为45.8 kD。生物信息学分析显示所得基因具有典型的TIAR蛋白质特征,与其他植物来源的类TIAR蛋白也具有较高同源性,认为该序列为编码葡萄类TIAR蛋白的基因。实时荧光定量PCR技术分析结果显示,VvTIAR-like在‘无核白’与‘黑比诺’胚珠发育过程中表现出不同的表达模式。在‘无核白’胚珠开始败育的前期和关键时期,该基因表现出明显的表达高峰,而在‘黑比诺’中则表达量低且无明显变化。【结论】获得了‘无核白’葡萄中类TIAR基因VvTIAR-like的cDNA全长,对该基因在无核葡萄品种‘无核白’和有核葡萄品种‘黑比诺’胚珠发育过程中的表达分析显示,VvTIAR-like可能与‘无核白’葡萄胚珠败育相关。

vvi-miR172s及其靶基因响应赤霉素调控葡萄果实发育的作用分析

【目的】miR172是植物生长发育的重要调节因子,阐释vvi-miR172s及其靶基因应答赤霉素在葡萄果实不同组织发育过程中的作用,从miRNA角度认识GA调控葡萄果实发育的作用机制。【方法】以‘白罗莎里奥’葡萄为材料,以miR-RACE和PCR技术克隆vvi-miR172a/b/c/d的成熟体和前体序列,由psRNA Target软件预测vvi-miR172s的靶基因;利用RLM-RACE技术验证vvi-miR172s剪切靶基因的裂解作用及其作用位点;采用生物信息学软件对靶基因、靶蛋白进行系统进化、序列结构分析及亚细胞定位预测;通过在线软件PLANTCARE进行启动子作用元件分析;通过qRT-PCR和芯片数据分析vvi-miR172s和靶基因在不同器官、不同发育阶段的基因表达图谱,以及应答GA3在果实不同组织中的时空表达模式。【结果】克隆鉴定了vvi-miR172a/b/c/d的成熟体和前体序列,预测到VvAP2、VvRAP2-1、VvRAP2-2和VvRAP2-3四个靶基因,验证到裂解产物及其裂解位点,证明它们为vvi-miR172s的真实靶基因。序列结构分析显示,VvAP2、VvRAP2-1、VvRAP2-2、VvRAP2-3均含有10个外显子和9个内含子,其motif元件的种类和数量相似,均含有两个排列顺序相近的AP2蛋白结构域,表明其结构和功能具有一定的保守性;且VvAP2、VvRAP2-1和VvRAP2-2与杨树的亲缘关系较近,VvRAP2-3与大豆具有较高的同源性;靶基因蛋白二级结构均为α-螺旋,可进一步折叠为稳定的三级结构;4个靶蛋白亚细胞定位主要位于细胞核内。启动子作用元件分析发现vvi-miR172c和VvRAP2-1中含有赤霉素响应元件,表明它们可能响应赤霉素调控葡萄生长发育;芯片数据分析显示vvi-miR172c和靶基因的表达模式具有组织或器官特异性,且它们之间呈现一定的负相关,表明它们之间存在负调控作用;RT-qPCR结果显示,随着葡萄果实的发育,果皮中vvi-miR172a/b/d呈下降的表达趋势,而靶基因VvRAP2-1的表达模式相反,表明vvi-miR172a/b/d对VvRAP2-1负调控;果肉中vvi-miR172d的表达水平降低,而靶基因VvAP2的表达水平增加,表明vvi-miR172d与VvAP2呈负相关性。另外,GA3处理改变了vvi-miR172s的靶模式,增强了果肉和果皮组织中vvi-miR172d与VvRAP2-1的负相关性,同时诱导了vvi-miR172c对VvAP2/VvRAP2-2/VvVvRAP2-3的负调控作用。【结论】VvAP2、VvRAP2-1、VvRAP2-2、VvRAP2-3均为葡萄miR172a/b/c/d的真实靶基因,vvi-miR172家族可能通过vvi-miR172a/b/d和vvi-miR172d分别介导靶基因VvRAP2-1和VvAP2调控果皮和果肉组织的发育过程,而vvi-miR172c和vvi-miR172d及其靶基因可能是GA调控葡萄果皮与果肉组织发育的主要作用因子。